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活性氧檢測試劑盒 solarbio 細胞檢測試劑
產(chǎn)品編號:CA1410
活性氧檢測試劑盒 solarbio 細胞檢測試劑
產(chǎn)品簡介:
活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物(O2•−, H2O2, •OH, ONOO−, •NO)等,參與細胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。采用2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)是迄今常用、靈敏的細胞內(nèi)活性氧檢探針。 DCFH-DA沒有熒光,進入細胞后被酯酶水解為dichlorofluorescin (DCFH)。在活性氧存在時DCFH被氧化為不能透過細胞膜的強綠色熒光物質(zhì)dichlorofluorescein (DCF),其熒光在激發(fā)波長 502 nm,發(fā)射波長 530 nm附近有大波峰,強度與細胞內(nèi)活性氧水平成正比。此活性氧檢測系統(tǒng)本底低,靈敏度高,重復(fù)性好,操作簡便。
本活性氧檢測試劑盒適于熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等圖像檢測,和微板熒光分析儀(multiwell fluorescence plate reader)、流式細胞儀定量 ROS檢測。
活性氧檢測試劑盒 solarbio 細胞檢測試劑工作波長:
佳激發(fā)波長 500、485 (500 ± 15 nm),佳發(fā)射波長 525 (530 ± 20 nm)。也可按照 FITC 熒光檢測條件檢測。
活性氧檢測試劑盒 solarbio 細胞檢測試劑操作步驟:
一、試劑準(zhǔn)備:
1. DCFH-DA 可稀釋于培養(yǎng)基或緩沖液中。血清或培養(yǎng)基顏色并不影響 DCFH-DA 及細胞內(nèi)熒光產(chǎn)生,但可能會影響熒光顯微鏡觀察,干擾熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細胞儀熒光測定。可將 DCFH-DA 稀釋于無酚紅培養(yǎng)基或適宜的緩沖液如 PBS 中。這依賴于使用何種熒光設(shè)備進行測定。
2. 加入 DCFH-DA 的時機或孵育時間,以終能順利檢測細胞內(nèi)活性氧為目的。藥物處理時間較短(<2小時)或預(yù)計 ROS 效應(yīng)較弱,可先加或同時加入 DCFH-DA。反之,treat 刺激時間較長(>6 小時)或預(yù)計產(chǎn)生ROS效應(yīng)較強,可后加 DCFH-DA。
3. 活性氧供體含高純度 12 mM H2O2。加入細胞后其本身即是一種活性氧,而且在代謝過程中可產(chǎn)生其它類型的活性氧,均可使 DCFH-DA氧化為 DCF呈現(xiàn)強綠色熒光。因而,用戶可使用該試劑作為測試實驗系統(tǒng)或儀器的陽性試劑,以初步觀察細胞活性氧所產(chǎn)生的熒光的一般特征,并且也可以將該實際作為實驗的一個陽性對照。*該試劑的細胞工作濃度為 20~100 µM 或更低濃度,但超過 200µM 將產(chǎn)生細胞毒。如果用戶熟悉 ROS熒光或?qū)嶒灈]有必要采用陽性對照,可以不加該試劑。
二、加入熒光探針:
1. 加入 DCFH-DA 于培養(yǎng)基,*初始工作濃度為 10 µM。對不同的細胞和處理,DCFH-DA 工作濃度可為 100 nM~20 µM,需進行預(yù)實驗確定合適的濃度。總體稀釋倍數(shù)應(yīng)在 1:500~1000 以上以避免 DMSO 對細胞的影響。以 DMSO 作為溶劑對照。
2. 37 ºC 孵育細胞 30min~至幾個小時,通常 30-60min 即可。孵育時間長短與細胞類型、刺激條件、DCFH-DA濃度有關(guān)。
3. PBS洗滌細胞 2 次。
三、熒光檢測
采用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡圖像檢測照相,綠色熒光強度代表活性氧水平。也可進行微板熒光分析儀(multiwell fluorescence plate reader)實時或每 10 分鐘分時逐點檢測熒光強弱。對于流式細胞儀可將細胞用胰酶消化 PBS 洗滌后重懸檢測。
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