線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-10)
品牌：Solarbio 
貨號：CA1310
英文名稱 : Mitochondrial Membrane Potential Kit(JC-10 Assay) 
儲存條件 : -20 ℃避光保存，盡量避免反復(fù)凍融，
有效期：一年。 
單位 : 100T/盒
 
線粒體膜電位檢測試劑盒保存條件：  
20 ℃避光保存，盡量避免反復(fù)凍融，有效期一年。 超純水和JC-1 染色緩沖液（5 ×）也可4 ℃保存。  
產(chǎn)品簡介： 
線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）是一種以JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測。 
JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位 Ψm  △ 的理想熒光探針?？梢詸z測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC 1 聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1 不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時 JC-1 為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣線粒體膜電位檢測試劑盒就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。 
線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。通過 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細(xì)胞膜電位的下降，同時也可以用JC 1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個檢測指標(biāo)。 
JC-1 單體的大激發(fā)波長為 515nm，大發(fā)射波長為529nm；JC-1 聚合物的大激發(fā)波長為585nm，大發(fā)射波長為590nm。實(shí)際觀察時，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。 
本試劑盒提供了 CCCP 作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽性對照。對于六孔板中的樣品，本線粒體膜電位檢測試劑盒共可以檢測100個樣品；對于12孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測200 個樣品。 
操作步驟：   
1、JC-1染色工作液的配制：    
六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量為1mL，其他培養(yǎng)器皿的JC-1染色工作液的用量以此類推；
對于細(xì)胞懸液每50～100萬細(xì)胞需0.5mLJC-1染色工作液。取適量JC-1 （200×），按照每50L JC-1（200×）加入8mL超純水的比例稀釋JC-1 。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1。然后再加入2mLJC-1染色緩沖液（5 ×），混勻后即為JC-1染色工作液。   
2、陽性對照的設(shè)置：              
 把線粒體膜電位檢測試劑盒中提供的CCCP（10mM ）*按照1：1000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至10M，處理細(xì)胞 20 分鐘。隨后按照下述方法裝載 JC-1，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測。對于大多數(shù)細(xì)胞，通常10MCCCP 
處理 20分鐘后線粒體的膜電位會*喪失，JC-1染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng)JC-1染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對于特定的細(xì)胞，CCCP 的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料決定。 
3、對于懸浮細(xì)胞： 
（1）取 10～60 萬細(xì)胞，重懸于0.5mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。  
（2）加入0.5mLJC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37 ℃孵育20 分鐘。  
（3）在孵育期間，按照每1mL JC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。  
（4）37℃孵育結(jié)束后，600g 4 ℃離心3 ～4 分鐘，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。  
（5）用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌 2 次：加入 1mL JC-1染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g 4 ℃離心3～4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入1mLJC-1 染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g 4 ℃離心 3～4 分鐘，
沉淀細(xì)胞，棄上清。  
（6）再用適量JC-1染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細(xì)胞儀分析。 
4、對于貼壁細(xì)胞 ： 
注意：對于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細(xì)胞儀檢測，可以先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測方法。  
（1）對于六孔板的一個孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可以用 PBS 或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入1mL 細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。  
（2）加入 1mL JC-1 染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20 分鐘。  
（3）在孵育期間，按照每 1mL JC 1 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。  
（4）37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用 JC 1 染色緩沖液（1×）洗滌2 次。  
（5）加入2mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。  
（6）熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。 
5、對于純化的線粒體： 
（1）把配制好的 JC-1染色工作液再用JC-1染色緩沖液（1×）稀釋5 倍。  
（2）0.9mL 5 倍稀釋的 JC-1染色工作液中加入 0.1mL總蛋白量為10 ～100g 純化的線粒體。 
（3）用熒光分光光度計或熒光酶標(biāo)儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進(jìn)行時間掃描（time scan ），激發(fā)波長為 485nm ，發(fā)射波長為 590nm 。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長不能設(shè)置為 485nm 時，可以在475～520nm 范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。另外，也可以參考下面步驟6 中的波長設(shè)置進(jìn)行熒光檢測。  
（4）用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟 6 。 
6、熒光觀測和結(jié)果分析 ： 
檢測 JC-1單體時可以把激發(fā)光設(shè)置為 490nm ，發(fā)射光設(shè)置為 530nm ；檢測 JC-1聚合物時，可以把激發(fā)光設(shè)置為525nm ，發(fā)射光設(shè)置為590nm 。   
 
注意：此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在大激發(fā)波長和大發(fā)射波長。如使用熒光顯微
鏡觀察，檢測 JC-1單體時可以參考觀察其它綠色熒光時的設(shè)置，如觀察GFP或FITC時的設(shè)置；檢測JC-1 聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或Cy3 時的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，
并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。  
線粒體膜電位檢測試劑盒注意事項(xiàng) ：   
1.  JC-1 （200×）在4 ℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。  
2.  必須先把JC-1（200×）用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后，才可以加入JC 1 染色緩沖液（5×）。不可先配制JC-1染色緩沖液（1×）再加入JC-1（200×），這樣JC-1會很難充分溶解，會嚴(yán)重影響后續(xù)的
檢測。  
3.  裝載完JC-1后用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌時，使JC-1染色緩沖液（1×）保持4 ℃左右，此時的洗滌效果較好。  
4.  JC-1探針裝載完并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。  
5.  請勿把 JC-1染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1染色緩沖液（5×）。  
6.  如果發(fā)現(xiàn)JC-1染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進(jìn)溶解可以在37℃加熱。   
7.  CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護(hù)。  
8.  為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
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G1067    番紅染色液（沙黃）    10/100/500ml
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