丙酮酸脫氫酶（PDH）活性檢測試劑盒說明書  微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC0385

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

丙酮酸脫氫酶（PDH）活性檢測試劑盒 微量法

丙酮酸脫氫酶（PDH）活性檢測試劑盒 微量法

溶液的配制：

1. 試劑二：為易揮發(fā)試劑，用完后盡快密封，-20℃保存。

2. 工作液的配制：臨用前把5.75mL試劑四、一支試劑五、0.45mL試劑六、1.75mL試劑七轉(zhuǎn)移到一瓶試劑三中混合溶解待用（共15.45mL，約85T）；用不完的試劑-20℃分裝保存，可保存4周。避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說明：

PDH（EC 4.1.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭，把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來。

PDH催化丙酮酸脫氫，同時還原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而導(dǎo)致605nm光吸收的減少。

Pyruvic Acid + Thiamine Pyrophosphate             Hydroxyethyl Thiamine Pyrophosphate

Dichlorophenolindophenol(605nm) + Hydroxyethyl Thiamine Pyrophosphate       Reduced Dichlorophenolindophenol

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：稱取約 0.1g 組織，加入1mL 試劑一和 10μL試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿充分研磨，4 ℃ 11000g離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 細(xì)胞或者細(xì)菌樣本：先收集500萬細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；之后加入1mL試劑一和 10μL試劑二，冰浴超聲波破碎細(xì)菌（功率200 W，超聲3 s，間隔7 s，總時間5 min）；然后11000g，4℃，離心10 min，

取上清置于冰上待測。

3. 血清（漿）及其它液體樣本：直接檢測。若溶液有渾濁則離心后去上清進(jìn)行測定。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至605nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2、 每個樣本需要180μL工作液，根據(jù)實驗所需取出一定量的工作液置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴鍋中水浴10min。

3、 空白管：在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL水，混勻，立即記錄605nm處10s處吸光值A1和 1min10s后的吸光值A2，計算ΔA空白=A1-A2。空白管只需測1-2次。

4、 測定管：在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL樣本，混勻，立即記錄605nm處10s處吸光值A3和1min10s后的吸光值A4，計算ΔA測定=A3-A4。

三、PDH活性計算

a.用微量比色皿測定的計算公式如下

1. 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/mg prot）=[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T

                        =904.762×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/g 質(zhì)量）=[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

                        =913.81×(ΔA測定-ΔA空白)÷W

3. 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/10⁴ cell）=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500)÷T

                        =1.828×(ΔA測定-ΔA空白)

4. 按樣本體積計算

單位的定義：每mL液體在反應(yīng)體系中每分鐘消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/mL）=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷V樣÷T

=904.762×(ΔA測定-ΔA空白)

   V反總：反應(yīng)體系總體積，1.9×10^-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01mL；T：反應(yīng)時間，1min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1．按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/mg prot）=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T

                        =1809.524×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr

2．按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/g 質(zhì)量）=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

                       =1827.62×(ΔA測定-ΔA空白)÷W

3．按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/10⁴ cell）=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T

                        =3.655×(ΔA測定-ΔA空白)

4．按樣本體積計算

單位的定義：每mL液體在反應(yīng)體系中每分鐘消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/mL）=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷V樣÷T

=1809.524×(ΔA測定-ΔA空白)

V反總：反應(yīng)體系總體積，1.9×10^-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L/mol/ cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01mL；T：反應(yīng)時間，1min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

注意事項：

1、測定過程中所有樣本在冰上放置并于2小時內(nèi)檢測，以免變性和失活。

2、測定管的ΔA值在0.01-0.25之間，若測定管的ΔA值大于0.25，需將樣本進(jìn)行稀釋。計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。若測定管的ΔA值小于0.01，需加大樣本量后重新測定，注意同步修改計算公式。

3、由于試劑一中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣品蛋白濃度時需要減去試劑一的蛋白含量。

實驗實例：

1、 取0.1g小鼠肝臟加入1mL試劑一和10μL試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿充分研磨，4℃、11000g離心10min，取上清置冰上，按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA測定=A3-A4=1.3106-1.1183=0.1923，ΔA空白=A1-A2 =1.3325-1.3314=0.0011，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

PDH活性(U/g質(zhì)量)= 913.81×(ΔA測定-ΔA空白)÷W=1747 U/g質(zhì)量。

相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

[1] Peng S, Wang Y, Zhou Y, et al. Rare ginsenosides ameliorate lipid overload-induced myocardial insulin resistance via modulating metabolic flexibility[J]. Phytomedicine, 2019, 58: 152745.

參考文獻(xiàn)：

[1] Guitart M, Andreu A L, García-Arumi E, et al. FATP1 localizes to mitochondria and enhances pyruvate dehydrogenase activity in skeletal myotubes[J]. Mitochondrion, 2009, 9(4): 266-272.

相關(guān)系列產(chǎn)品：

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