一、簡(jiǎn)介:  

上海青旗生物有限公司提供ATCC原代細(xì)胞，ATCC菌株代購(gòu)，同時(shí)上海青旗生物新增細(xì)胞庫(kù)，具有自己的研發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)庫(kù)，上千株細(xì)胞具有STR鑒定，開(kāi)春大放送，*，同時(shí)還有好禮相送，具體歡迎咨詢(xún)我們銷(xiāo)售人員。。。。  

二、原代細(xì)胞培養(yǎng)介紹：  

(1)原理細(xì)胞培養(yǎng)(Cellculture)是模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，將細(xì)胞從機(jī)體中取出，在人工條件下使其生存、生長(zhǎng)、繁殖和傳代，進(jìn)行細(xì)胞生命過(guò)程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問(wèn)題的研究。近年來(lái)，廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞工程等領(lǐng)域，發(fā)展成一種重要生物技術(shù)，并取得顯著成就。由體內(nèi)直接取出組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細(xì)胞離體時(shí)間短，性狀與體內(nèi)相似，適用于研究。一般說(shuō)來(lái)，幼稚狀態(tài)的組織和細(xì)胞，如：動(dòng)物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進(jìn)行原代培養(yǎng)。  

(2)操作：1．取材用頸椎脫位法使乳兔迅速死亡。然后，把整個(gè)動(dòng)物浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺(tái)。用消過(guò)毒的剪刀剪開(kāi)用碘酒和乙醇再次消毒后的皮膚，剖腹取出肝臟或腎臟。置于無(wú)菌平皿中。2．切割用滅菌的PBS液將取出的臟器清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用PBS清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。移入無(wú)菌離心管中，靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清。3．消化、接種培養(yǎng)吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入離心管中，與組織塊混勻后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分鐘，每隔幾分鐘搖動(dòng)一下試管，使組織與消化液充分接觸，靜止，吸去上清，向離心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培養(yǎng)基，用吸管吹打混勻，移入二個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。  

(3)結(jié)果細(xì)胞接種后一般幾小時(shí)內(nèi)就能貼壁，并開(kāi)始生長(zhǎng)，如接種的細(xì)胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。  

三、器材及液體的準(zhǔn)備和無(wú)菌操作的注意事項(xiàng)：  

(1)器材和液體的準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)用的玻璃器材，如：培養(yǎng)瓶、吸管等在清洗干凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，120℃，2小時(shí)干烤滅菌后備用；手術(shù)器材、瓶塞、配制好的PBS液用滅菌鍋15磅，20分鐘蒸氣滅菌；MEM培養(yǎng)液、小牛血清、消化液用G6濾器負(fù)壓抽濾后備用。  

(2)無(wú)菌操作中的注意事項(xiàng)在無(wú)菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無(wú)菌清潔。為此，在操作前要認(rèn)真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分鐘起動(dòng)超凈臺(tái)吹風(fēng)。操作時(shí)，嚴(yán)禁說(shuō)話，嚴(yán)禁用手直接拿無(wú)菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血鉗、鑷子等去拿。培養(yǎng)瓶要在超凈臺(tái)內(nèi)才能打開(kāi)瓶塞，打開(kāi)之前用乙醇將瓶口消毒，打開(kāi)后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下，打開(kāi)瓶口后的操作全部都要在超凈臺(tái)內(nèi)完成。操作完畢后，加上瓶塞，才能拿到超凈臺(tái)外。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出后要手拿末端，將*在火上燒一下，戴上膠皮**，然后再去吸取液體?？傊谡麄€(gè)無(wú)菌操作過(guò)程中都應(yīng)該在酒精燈的周?chē)M(jìn)行。  

四、ATCC原代細(xì)胞凍存方法：  

（1）選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在凍存前一天*換液。將多個(gè)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液去掉，用0.25%胰蛋白酶消化。適時(shí)去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液。懸浮生產(chǎn)細(xì)胞則不要消化處理。然后將細(xì)胞收集于離心管中離心（1000r/min，10分鐘）。  

（2）去上清液，加入含20%小牛血清的*培養(yǎng)基，于4℃預(yù)冷15分鐘后，逐滴加入已無(wú)菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，細(xì)胞濃度為3×106～1×107/mL之間。  

（3）將上述細(xì)胞分裝于安瓿或冷凍塑料管中，安瓿裝1～1.5mL在火焰噴燈上封口，封口處要*封閉，圓滑無(wú)勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標(biāo)記好細(xì)胞名稱(chēng)和凍存日期，同時(shí)作好登記（日期、細(xì)胞種類(lèi)及代次、凍存支數(shù)）。  

（4）將裝好細(xì)胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內(nèi)；置于液氮容器頸口處存放過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安瓿置入4℃冰箱中2～3小時(shí)，再移至冰箱冷凍室內(nèi)3～4小時(shí)（此步可省略），再吊入液氮容器頸氣態(tài)部分存放2小時(shí)，蕞后沉入液氮中。  

（5）細(xì)胞凍存在液氮中可以長(zhǎng)期保存，但為妥善起見(jiàn)，凍存半年后，*取出一只安瓿細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況，然后再繼續(xù)凍存。  

五、細(xì)胞的復(fù)蘇：  

1、細(xì)胞復(fù)蘇的原則  

在實(shí)際操作中，凍存細(xì)胞要進(jìn)行復(fù)蘇，再培養(yǎng)傳代。復(fù)蘇細(xì)胞一般采用快速融化法。以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞。  

2、細(xì)胞復(fù)蘇的主要操作步驟  

(1)佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。  

(2)迅速放入38℃水浴中，并不時(shí)搖動(dòng)，在1分鐘內(nèi)使其*融化，然后在無(wú)菌下取出細(xì)胞。  

(3)在1000r/min速度下離心5～10分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1×109/L，置37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況。