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 競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量成反比。操作步驟如下：  

  （1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。  

  （2）待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原醫(yī)學(xué)教丨育網(wǎng)整理的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)充分的量。洗滌。  

  （3）加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原多，故顏色深。參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測(cè)管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多 

1 包被抗原，酶標(biāo)二抗進(jìn)行的間接競(jìng)爭(zhēng)法2 包被抗原，酶標(biāo)一抗進(jìn)行的標(biāo)記抗體直接競(jìng)爭(zhēng)法3 包被抗體，標(biāo)記抗原進(jìn)行的標(biāo)記抗原直接競(jìng)爭(zhēng)法，  

雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原的方法，操作步驟如下：  

  雙抗體夾心法

一、將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

二、加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。

三、加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。

四、加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量

根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中的抗體。

雙向擴(kuò)散試驗(yàn)沉淀線的形態(tài)和位置的4種分析 

   1．抗原或抗體的存在與否及其相對(duì)含量的估計(jì)  沉淀線的形成是根據(jù)抗原抗體兩者比例所致。沉淀線如靠近抗原孔，則指示抗體含量較大；如靠近抗體

孔，則指示抗原含量較多。不出現(xiàn)沉淀線則表明抗體或抗原過剩。另外，如出現(xiàn)多條沉淀線，則說明抗原和抗體皆不是單一的成分。因此，可用于鑒定抗原或抗體的純度。

雙擴(kuò)散各種孔型圖

    2．抗原或抗體相對(duì)分子量的分析  抗原或抗體在瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，其速度受分子量的影響。分子量小者擴(kuò)散快，反之則較慢。由于慢者擴(kuò)散圈小，局部濃度較大，形成的沉淀線彎向分子量大的一方。如若兩者分子量相等，則形成直線。圖顯示左側(cè)沉淀線抗原分子量大于抗體，右側(cè)沉淀線則抗體大于抗原，中間一條線則為兩者相等?？贵w多為IgG，分子量約15kD，未知抗原的分子量可做粗略估計(jì)。

抗原抗體相對(duì)分子量示意圖

    3．用于抗原性質(zhì)的分析  兩種受檢抗原的性質(zhì)可*相同、部分相同或*不同。三種情況在雙向擴(kuò)散中表現(xiàn)的基本圖形見圖

三種雙擴(kuò)散基本圖形

    從圖可以分析出，左圖中兩種受檢抗原(Ag-a)*相同，形成一個(gè)*融合的沉淀線；右圖中抗體為雙價(jià)，兩種抗原*不同(Ag-a和Ag-c)；中圖的抗體為雙價(jià)，兩種抗原(Ag-ab和Ag-ac)皆有相同的a表位，又有不同的b和c表位，所以沉淀線呈部分融合的形狀。這種技術(shù)作為抗原的分析，是目前免疫化學(xué)中用的鑒定技術(shù)之一

    4．用于抗體效價(jià)的滴定  雙向擴(kuò)散技術(shù)是抗血清抗體效價(jià)滴定的常規(guī)方法。固定抗原的濃度、稀釋抗體；或者抗原、抗體雙方皆作不同的稀釋，經(jīng)過自由擴(kuò)散，形成沉淀線。出現(xiàn)沉淀線的抗體稀釋度為該抗體的效價(jià)。

    免疫電泳是指一定量可溶性的抗原物質(zhì)與相應(yīng)抗體借用瓊脂糖為載體在一定電場(chǎng)強(qiáng)度下以合適的比例加速結(jié)合形成復(fù)合物，并以沉淀線(或峰)的形式表現(xiàn)出來，通過觀察和分析沉淀線(或峰)的性質(zhì)而對(duì)抗原抗體進(jìn)行定性定量。該技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。這種技術(shù)有兩大優(yōu)點(diǎn)，一是加快了沉淀反應(yīng)的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)，以此做更細(xì)微的分析。免疫電泳技術(shù)的種類很多，這里僅將常用的技術(shù)介紹如下。

電泳的基本原理  

電泳是指帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。

目前使用得多的是瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。蛋白質(zhì)電泳主要使用聚丙烯酰胺凝膠。  

電泳裝置主要包括兩個(gè)部分：電源和電泳槽。電源提供直流電，在電泳槽中產(chǎn)生電場(chǎng)，驅(qū)動(dòng)帶電分子的遷移。電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類。垂直板式電泳是較為常見的一種，常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質(zhì)的分離

帶電分子由于各自的電荷和形狀大小不同，因而在電泳過程中具有不同的遷移速度,有些類型的電泳幾乎*依賴于分子所帶的電荷不同進(jìn)行分離，如等電聚焦電泳；而有些類型的電泳則主要依靠分子大小的不同即電泳過程中產(chǎn)生的阻力不同而得到分離，如SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳。分離后的樣品通過各種方法的染色，或者如果樣品有放射性標(biāo)記，則可以通過放射性自顯影等方法進(jìn)行檢測(cè).  

瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響  

1、DNA的分子大小及構(gòu)型  

不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗﹥r(jià)閉環(huán)DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。當(dāng)瓊脂糖濃度太高時(shí)，環(huán)狀DNA（一般為球形）不能進(jìn)入膠中，相對(duì)遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長軸方向前進(jìn)（Rm>0），由此可見，這三種構(gòu)型的相對(duì)遷移率主要取決于凝膠濃度。  

2、瓊脂糖濃度  

一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于 DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。  

3、DNA分子的構(gòu)象  

當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的,超螺旋DNA移動(dòng),而線狀雙鏈DNA移動(dòng)慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí),可從瓊脂糖凝膠上將

DNA帶逐個(gè)回收,用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。  

4、電源電壓  

瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實(shí)驗(yàn)條件的研究結(jié)果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場(chǎng)強(qiáng)度增加時(shí)，不同分子量的DNA段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA段的分辨率達(dá)到大電場(chǎng)強(qiáng)度不宜高于5V/cm。  

5、嵌入染料的存在  

熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15％。  

6、離子強(qiáng)度影響  

電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率小,DNA幾乎不移動(dòng),在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。對(duì)于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成濃縮母液,儲(chǔ)于室溫。  

質(zhì)粒完整的話可以形成超螺旋結(jié)構(gòu)；如果有部分單鏈斷裂，還是可以保持環(huán)狀，但是無法超螺旋，要跑慢一點(diǎn)；如果雙鏈鍛裂，變成線性分子，就跑慢。 

電泳出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，英文成為smear，就是彌散。其原因，主要從以下兩個(gè)方面考慮：  

1、PCR產(chǎn)物自身原因： 

往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多，而造成PCR的非特異性產(chǎn)物 過多。 

對(duì)策：①減少Taq酶的量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少引物的用量 ，減少循環(huán)次數(shù)，提高退火溫度。 

2、電泳體系的問題： 

（1）電泳緩沖液TAE或者TBE的污染，建議更換緩沖液。（2）上樣時(shí)樣品漂了，建議增加上樣緩沖液的用量，以及小心加樣。（3）電壓太高。（4）適當(dāng)把你的膠的濃度加大。（根據(jù)你的片斷大小而定）（5）觀察你的marker是否也存在拖尾現(xiàn)象，作為對(duì)照。 

引物 

你是想擴(kuò)基因還是啟動(dòng)子??？ 

一般基因的話，你可以用親緣關(guān)系比較近的物種的該基因的序列設(shè)計(jì)引物，序列可以在NCBI上查到的，如果是啟動(dòng)子，就可以采用接頭PCR，或者是設(shè)簡(jiǎn)并 

引物來擴(kuò)，方法很多的 

 （二）假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶 

1、模板  

①模板中含有雜質(zhì)。 

②模板中含有Taq酶抑制劑。 

③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的 

    組蛋白。 

④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。 

⑤模板核酸變性不*。  

 2、酶失活  

3、引物  

引物質(zhì)量； 

引物的濃度； 

兩條引物的濃度是否對(duì)稱； 

是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見 

原因。  

 對(duì)策為：  

①選定一個(gè)好的引物合成單位。 

②引物的濃度不僅要看吸光度值A，更要注重引物原液 

    做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩 

    引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條 

    引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成 

    單位 協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在 

    稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。 

③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放 

    冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。 

④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二 

    聚體等。 

 4、Mg2+濃度  

5、反應(yīng)體積的改變  

6、物理原因  

7、靶序列變異  

（三）假陽性 

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其 

條帶更整齊，亮度更高。 

1、引物設(shè)計(jì)不合適  

選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在 

進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR 產(chǎn)物為非目的性的序 

列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重 

新設(shè)計(jì)引物。  2、靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染  

（1）整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。  

 ②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng) 

    高壓消毒。  

③所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。  

（2）空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列 

      短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ) 

      后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生。 

      可用巢式PCR方法來減輕或消除。  解決方法： 

①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或 

    濺出離心管外。  

（四）出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或 

小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。  

原因：  

一是引物與靶序列不*互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚 

體。 

二是 Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及 PCR循環(huán) 

次數(shù) 過多有關(guān)。  

 對(duì)策有：  

必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。 

減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。 

降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。 

適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法  

（五）出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 

減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。 

減少dNTP的濃度。 

適當(dāng)降低Mg2+濃度。 

增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。 

十四、PCR污染與對(duì)策 

（一）污染原因 

1、標(biāo)本間交叉污染  

2、PCR試劑的污染  

3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染  

4、可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染  

5、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染  

 （二）污染的監(jiān)測(cè) 

1、對(duì)照試驗(yàn) 

（1）陽性對(duì)照  

（2）陰性對(duì)照  

2、重復(fù)性試驗(yàn) 

3、選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 

（三）防止污染的方法 

1、合理分隔實(shí)驗(yàn)室  

①標(biāo)本處理區(qū); ②PCR反應(yīng)液制備區(qū); ③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū); ④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)  

其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用 

紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。  

 2、吸樣槍  

3、預(yù)混和分裝PCR試劑  

4、防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離 

      心管應(yīng)一次性使用。 

5、設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照  

6、減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就 

      適可而止。 

7、Eppendorf管的使用