破骨細(xì)胞培養(yǎng)操作方法

1. 使用raw細(xì)胞：

（1） 先消化，按96孔板 每孔5000-10000（具體的密度要自己摸）鋪板。

（2）第二天開始誘導(dǎo)，用10%血清α-men 50ng/ml的rankl誘導(dǎo)，直至出破骨。Raw比較難。 

2. 使用原代細(xì)胞：

小鼠后肢股骨脛骨的骨髓沖出細(xì)胞打散，用10%FBS的α-men  （20ng/ml  mcsf）養(yǎng)5天，第三天的時(shí)候換液。5天后鋪板。

按96孔板每孔8000-10000鋪板，第二天開始誘導(dǎo)，用10%血清α-men 20ng/ml的mcsf 50ng/ml的rankl 誘導(dǎo)。原代多個(gè)mcsf 并且要多養(yǎng)5天的原代。

破骨細(xì)胞培養(yǎng)問答：

Q1: 我想用小鼠的骨髓來源的巨噬細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)，但是巨噬細(xì)胞很難消化，這個(gè)問題怎么解決？

A1:  PBS沖洗，加胰酶消化（8分鐘左右，觀察后再?zèng)Q定是否需要更久）；加培養(yǎng)基中和，用移液槍反復(fù)吹，使細(xì)胞脫板，離心，培養(yǎng)基重懸，然后鋪板加rankl誘導(dǎo)。

Q2：破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過程中，加入了m-csf和rankel，需要養(yǎng)多久？中間需要換液?jiǎn)?，換液的頻率是什么樣的？

A2：培養(yǎng)基2天一換，一般4天出細(xì)胞，不行再養(yǎng)6-8天。細(xì)胞密度要控制好，96孔板8000－10000，六孔板20萬，其他孔板按照這個(gè)密度來算就行了。

Q3：骨吸收觀察方法有哪些：

A3： （1）甲苯胺藍(lán)（2）電鏡評(píng)估，（3）破骨細(xì)胞f-actin ring免疫熒光。

 電鏡的話不用甲苯胺藍(lán)，直接細(xì)胞洗掉去拍就行了。 熒光普通的方法染，用actin 抗體 ，細(xì)胞膜就染上了