流式細胞術實驗原理

待測樣品(如細胞、染色體、精子或細菌等)經(jīng)熒光染料染色后制成樣品懸液，在一定壓力下通過殼液包圍 的進樣管而進入流動室，排成單列的細胞，由流動室的噴嘴噴出而成為細胞液流，并與入射激光束相交。 細胞被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，由放在與入射的激光束和細胞液流成 90°處的光學系統(tǒng)收集之。光學系統(tǒng)中的阻 斷濾片用于阻擋激發(fā)光；二色分光鏡及另一些阻斷濾片則用于選擇熒光波長。熒光檢測器為光電倍增管。 散射光檢測器是光電二極管，用以收集前向散射光。小角度前向散射與細胞大小有關。

整個儀器用多道脈沖高度分析器處理熒光脈沖信號和光散射信號。測定的結果用單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點圖、三維立體圖和輪廓（等高）圖來表示。

對細胞進行分選的原理是，由超聲振蕩器產(chǎn)生高頻振蕩，使流動室發(fā)生振動，把噴嘴噴出的細胞液流斷裂成一連串的均勻小液滴，有的液滴含有細胞。這些細胞在形成液滴前，光學系統(tǒng)已測定了它們的信號（代表細胞的性質(zhì)），如果測得信號與所選定的要進行分選的細胞性質(zhì)符合，或者說，如果發(fā)現(xiàn)了要進行分選的細胞時則在這個選定細胞剛形成液滴時，儀器給整個液流充以短暫的正或負電荷。當該液滴離開液流后，其中被選定細胞的液滴就帶有電荷，而不被選定的細胞液滴則不帶電。帶有正電或負電的液滴通過高壓偏轉(zhuǎn)板時發(fā)生向陰極或向陽極的偏轉(zhuǎn)，從而達到了分類收集細胞的目的。

1、檢測指標： DNA倍體分析、DNA含量分析、細胞周期、細胞凋亡；細胞表面抗原分析：淋巴細胞免疫分型、白血病及淋巴瘤免疫分型、血小板相關抗體分析、PNH相關抗原檢測（CD55/CD59）、胞內(nèi)細胞因子檢測等。

2、樣本及來源：

1) 細胞數(shù)量達到檢測所需（細胞周期1x106、細胞凋亡3x106）,生長良好，無污染，附有細胞生長照片， 注明實驗檢測項目所需試劑盒；來源于人、小鼠、大鼠或其它。

2) 外周血：EDTA或肝素抗凝全血，5ml左右；來源于人、小鼠、大鼠或其它。

3）試劑：部分常用熒光探針，如PI等，我公司可免費提供；特殊標記物，如CD抗體等，用戶須另行購買，我公司可以代購；用戶所提供抗體應可與樣本發(fā)生特異性識別反應。

4）樣品包裝要求：細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中或操作前樣本于合適的條件保存。

檢測說明：

1、用戶需要進行流式細胞儀檢測時須提前預約，同時說明實驗目的、方法等。zui低收費300元。

2、我公司在正式接受實驗委托一周內(nèi)交付實驗結果。所提供實驗結果忠實于樣本的實際情況。

3、用戶須一次性全額預付實驗費。

4、由用戶提供的樣品或試劑所致的實驗問題由用戶負責。

5、請在表中說明檢測具體要求，由于填寫資料不詳所致任何問題由用戶負責。

6、請在送樣的同時提供樣本來源及處理方法等信息，樣品檢測后原則上本公司不負責保存。

附：流式細胞術檢測樣品推薦制備方法

A. 直接標記抗體（FITC標記抗體）：

(1)收集1×106個細胞，800rpm離心5min，4℃以上冷PBS洗一次。

(2)用4%多.聚.甲.醛1ml室溫固定40分鐘，800rpm離心5min去上清。加2ml PBS重懸洗滌細胞，800rpm離 心5min。

(3)用1ml含5% 人血清的 PBS 重懸細胞，冰上孵育10min，800rpm離心5min去上清。加入200ul含 0.5%BSA 和飽和劑量的熒光標記抗體(5×105個細胞/20ul抗體)的PBS ,避光冰上放置30min,離心棄上清。 加入200ul 1% 多.聚.甲.醛固定，待測即可。

(4)用流式細胞儀檢測熒光值,每管計數(shù)10,000.00個細胞。

B. 未標記抗體間接免疫熒光標記法：

(1)收集2×106個細胞，用冷的PBS 2ml 洗滌細胞一次，800rpm離心5min。

(2)用2ml 4%多.聚.甲.醛室溫固定細胞40min,800rpm離心5min；2ml PBS重懸細胞，800rpm離心5min；

(3)用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重懸細胞，冰上放置10min,800rpm離心5min。 (4)加入飽和劑量未標記抗體，冰上放置40min,800rpm離心5min，用2ml冷的PBS 重懸細胞，800rpm離心 5min，洗去未結合一抗，重復一次。

(5)加入熒光標記（FITC）標記的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm離心5min，去上清，PBS洗滌兩 次。

(6)加入0.5ml 1%多.聚.甲.醛重懸細胞；固定待測。

(7)流式細胞儀檢測熒光值,每管計數(shù)10,000.00個細胞。

C.細胞周期、細胞凋亡及DNA倍體分析樣品（PI染色）的制備：

(1)待測樣本制成單細胞懸液，然后200g離心5分鐘，棄上清。

(2)用4℃預冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小時。

(3)調(diào)整細胞濃度為106細胞/毫升，取1毫升細胞懸液，用PBS洗三次，細胞重懸于1毫升PI染液中，37℃孵育30分鐘即可進行流式分析。

(4)PI染液終濃度為50微克/毫升，RNase A終濃度為20微克/毫升。

收費標準/服務周期/提供結果：

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