生物細(xì)胞培養(yǎng)遷移侵襲MTT轉(zhuǎn)染流式分選誘導(dǎo)

一、服務(wù)介紹

細(xì)胞遷移是指細(xì)胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動(dòng)。細(xì)胞遷移為細(xì)胞頭部偽足的延伸、新的黏附建立、細(xì)胞體尾部收縮在時(shí)空上的交替過程。細(xì)胞遷移是正常細(xì)胞的基本功能之一，是機(jī)體正常生長發(fā)育的生理過程，也是活細(xì)胞普遍存在的一種運(yùn)動(dòng)形式。胚胎發(fā)育、血管生成、傷口愈合、 免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥轉(zhuǎn)移等過程中都涉及細(xì)胞遷移。檢測細(xì)胞遷移能力的實(shí)驗(yàn)包括劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是簡捷測定細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)與修復(fù)能力的方法，在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上， 用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長的中yang區(qū)域劃線，去除中yang部分的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間是一種簡單易行的檢測細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方法，實(shí)驗(yàn)成本低，可以用來檢測貼壁生長腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。Transwell的基本原理是將transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱為下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，上室內(nèi)添加上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)添加下層培養(yǎng)液。將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細(xì)胞生長、運(yùn)動(dòng)等的影響。

三、實(shí)驗(yàn)流程

劃痕實(shí)驗(yàn)

1. 用marker筆在6孔板背后均勻得劃橫線；

2. 在孔中加入細(xì)胞；

3. 第二天用槍頭垂至于背后的橫線劃痕；

4. 用PBS洗去處劃下的細(xì)胞，培養(yǎng)不同時(shí)間，取樣，拍照；

5. 數(shù)據(jù)處理：每個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞整體遷移距離=每個(gè)時(shí)間點(diǎn)距離長度-0時(shí)距離；

6. 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。 

遷移實(shí)驗(yàn)（cell migration assay）

實(shí)驗(yàn)材料

（1）Transwell chamber: 24-well, 8.0-μm pore membranes (Corning)

（2）細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：無血清培養(yǎng)基，10％血清培養(yǎng)基，PBS，0.02％EDTA

（3）固定液：甲醇

（4）染色液：Giemsa染液

（5）封片劑：中性樹膠

（6）其他：小鑷子，棉棒，載玻片，蓋玻片

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) （cell invasion assay）

實(shí)驗(yàn)材料

（1）Matrigel (BD 5mg/ml)，-20℃保存

（2）其余材料同遷移實(shí)驗(yàn) 操作步驟

（3）Matrigel在4℃過夜融化；

（4）用4℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度1mg/ml，冰上操作；

（5）在chamber上室底部zhong央垂直加入100μl稀釋后的Matrigel，37℃溫育4－5小時(shí)使其干成膠狀；

（6）后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)（1-8）。

注意事項(xiàng)

（1）Matrigel在過高或過低的溫度均易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應(yīng)提前在4℃預(yù)冷； （2）鋪膠時(shí)保證液面水平，膠的厚度均勻一致，切勿產(chǎn)生氣泡；

（2）其他注意事項(xiàng)同遷移試驗(yàn)。

Transwell實(shí)驗(yàn)

1. 采用未鋪 Matrigel 膠的 Transwell 小室用于實(shí)驗(yàn)；

2. 制備細(xì)胞懸液；

3. 接種細(xì)胞；

4. 檢測穿過的細(xì)胞數(shù)；

5. 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。 

注意事項(xiàng)

（1）根據(jù)待測細(xì)胞體積大小選擇合適孔徑的chamber。常用的為8.0-μm孔徑（如AGS細(xì)胞），如果細(xì)胞 體積較大可以考慮用10-μm孔徑；

（2）根據(jù)待測細(xì)胞的遷移能力強(qiáng)弱調(diào)整細(xì)胞數(shù)和遷移時(shí)間。常規(guī)24-well chamber接種細(xì)胞數(shù)約為 2≈5×104/well，遷移時(shí)間12≈36小時(shí)；

（3）由于Corning公司的24-Transwell內(nèi)含12個(gè)獨(dú)立的chamber，為了避免操作污染，每次實(shí)驗(yàn)可預(yù)先另準(zhǔn)備一塊24孔普通培養(yǎng)板（Corning）；

（4）如果細(xì)胞遷移能力較弱，下室液體可用3T3細(xì)胞無血清培養(yǎng)24小時(shí)獲得的上清加50μg/ml FN （Fibronectin），具體可查閱相關(guān)文獻(xiàn)；

（5）細(xì)胞懸液加入膜zhong央，盡量保證液面水平；

（6）固定染色擦洗時(shí)動(dòng)作小心，避免擦去膜底面的細(xì)胞。但一定要充分擦凈膜表面上未遷移的細(xì)胞，以 免影響讀數(shù)。尤其是膜周邊上可用細(xì)牙簽或小鑷子纏上濕棉花擦洗，但要小心避免將膜戳破；

（7）Chamber和膜上都無法標(biāo)記，操作時(shí)應(yīng)小心避免混淆實(shí)驗(yàn)組和對照組；

（8）充分晾干，避免殘留水分導(dǎo)致鏡下聚焦不一致。

四、服務(wù)說明

1. 客戶提供：細(xì)胞株(凍存株或培養(yǎng)好的細(xì)胞)，所需藥品，藥物處理方式和濃度。

2. 公司提供：基本實(shí)驗(yàn)步驟、圖片、數(shù)據(jù)分析結(jié)果、剩余藥品。

3. 實(shí)驗(yàn)周期：大約2-3周左右，具體需要根據(jù)細(xì)胞生長情況及實(shí)驗(yàn)內(nèi)容而定。

服務(wù)對象：

1、在職或?qū)Ｂ毰R床研究生、博士生

● 實(shí)驗(yàn)室條件的不完備

● 文章設(shè)計(jì)不完善

● 臨床工作繁忙

● 實(shí)驗(yàn)條件摸索不成熟

● 科研時(shí)間嚴(yán)重不足

● ……

2、地市級三級醫(yī)院科室主任、主任醫(yī)師、主治醫(yī)師等

● 公務(wù)繁忙

● 無精力、時(shí)間查找文獻(xiàn)

● 沒有時(shí)間尋找領(lǐng)域內(nèi)新熱點(diǎn)

● 科研圈子氛圍不夠濃厚

● 需要更前沿的科研技術(shù)應(yīng)用

● 晉升、晉職需要

● ……

3、繁重科研任務(wù)的臨床醫(yī)生

● 文章設(shè)計(jì)不完善

● 科研任務(wù)繁重忙不過來

● 臨床工作繁忙，千頭萬緒

● 周圍環(huán)境和條件的局限

● 缺少實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

● ……

4、有志于科研的各級醫(yī)院臨床醫(yī)生/護(hù)士

● 奮戰(zhàn)在病房一線

● 時(shí)間都給了病人

● 有志于科研

● 心有余而力不足

● ……

整體外包服務(wù)介紹：星森林生物提供科研設(shè)計(jì)咨詢及輔助實(shí)施：相關(guān)文獻(xiàn)查閱、實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)可行性分析、基金標(biāo) 書撰寫、課題項(xiàng)目申請、整體實(shí)驗(yàn)實(shí)施、數(shù)據(jù)分析與處理、結(jié)題報(bào)告書寫以及課題相關(guān)資料培訓(xùn)。

● 根據(jù)客戶研究方向、基金標(biāo)書、實(shí)驗(yàn)課題外包目標(biāo)和要求，實(shí)驗(yàn)預(yù)算等設(shè)計(jì)可操作執(zhí)行的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方 案。

● 根據(jù)客戶研究團(tuán)隊(duì)的研究基礎(chǔ)，幫助客戶策劃、設(shè)計(jì)可執(zhí)行的研究路線及實(shí)驗(yàn)方案。

● 幫助客戶解決實(shí)驗(yàn)方案中需要突破的重要實(shí)驗(yàn)問題，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程。

● 指導(dǎo)客戶篩選和確定實(shí)驗(yàn)方案中所需要的試劑、抗體及相關(guān)耗材。

● 根據(jù)客戶需求推薦適合客戶的其他增值外包服務(wù)。

收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果：

歡迎咨詢詳談，我們會根據(jù)您的方案及需求制定詳細(xì)的服務(wù)協(xié)議。

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