Fluo-8 AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針 

產(chǎn)品簡介

Fluo-8（Fluo-2 Medium Affinity），是目前最亮的可見光激發(fā)波長Ca2+熒光探針，其熒光強度比Fluo-4強兩倍，比Fluo-3強四倍。Fluo-8具中等程度的Ca2+親和力，幾乎接近Fluo-3，F(xiàn)luo-4（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM、Fluo-4: Kd= 0.389μM），使用上幾乎同F(xiàn)luo-3和Fluo-4。Fluo-8不僅維持Fluo-3，F(xiàn)luo-4便捷的光譜檢測特性，與Ca2+結(jié)合后的最大激發(fā)波長為490nm，最大發(fā)射波長為514nm。而且具有改善的細(xì)胞載入和Ca2+響應(yīng)能力。Fluo-8加載具較弱的溫度依賴性，在室溫或37℃孵育皆染色良好，不像Fluo-3，F(xiàn)luo-4嚴(yán)格要求在37℃孵育，此特征使其更適用于HTS高通量篩選實驗。Fluo-8應(yīng)用廣泛，與許多細(xì)胞系和靶向樣本兼容，不會受配體或靶標(biāo)本身信號干擾。

Fluo-8可通過激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡等來檢測胞內(nèi)鈣離子水平的變化。Fluo-8, AM是Fluo-8的一種乙酰甲酯衍生物，具有細(xì)胞膜滲透性，只需簡單培養(yǎng)，即可輕易進入細(xì)胞。一旦進入細(xì)胞內(nèi)，即被其內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Fluo-8，從而滯留在胞內(nèi)以發(fā)揮相應(yīng)生理功能。

本品以50ug小包裝的凍干粉形式，用于細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平檢測時，推薦濃度1-5uM。

Fluo-8 AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針 

基本特性

同義名：Fluo-8, AM

分子式：C50H50N2O23

分子量：1046.9316       

溶解性：溶于DMSO（1-5 mM）   

Ex/Em：490/514nm（Ca2+結(jié)合）；

儲存條件：置于-20℃干燥保存，1年效期。

Fluo-8 AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針

使用方法

A 試劑準(zhǔn)備

1）配制Pluronic F-127母液：稱取100mg Pluronic F-127粉末（貨號：Cat No. FS0432）中加入500ul DMSO,配制成20%(W/V)母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min.溶液室溫保存，不用冷藏。如有結(jié)晶析出，可以重新加熱溶解，不影響使用。

2）HHBS BUFFER(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer,pH7.3)或者其他生理緩沖液

B 操作步驟

1）用無水DMSO溶解Fluo-8,AM配制成1-5mM的儲存液，或?qū)⒁雅浜玫腇luo-8,AM儲存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50ugFluo-8,AM中加入11.9ul無水DMSO）。

2）用HHBS或其他生理緩沖液Fluo-8,AM+DMSO儲存液稀釋到1-10uM的工作液，提前加入適量的20%Pluronic F-127溶液，使其終濃度為0.02%。

【注（1）】：Fluo-8,AM應(yīng)用在大部分細(xì)胞的推薦加載濃度為4-5uM,具體的使用濃度需根據(jù)實驗要求進行優(yōu)化。為了避免過度加載造成細(xì)胞毒性，建議在取得結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用zui低探針濃度。

【注（2）】：Fluo-8,AM工作液需現(xiàn)配使用，避免反復(fù)凍存。

【注（3）】：Pluronic F-127可以防止Fluo-8,AM在溶液中聚合并促使探針更好進入細(xì)胞。但Pluronic F-127可降低Fluo-8,AM的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時加入，不建議加入儲存液長期保存。

3）【可選】如果細(xì)胞內(nèi)含有機陰離子轉(zhuǎn)運體，丙磺su（Probenecid,1-2.5mM)或者，磺吡酮（Sulfinpyrazone,0.1-0.25mM）可能需要加入細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，以降低去酯化探針的泄露。

【注（1）】：丙磺su或磺吡酮儲存液相當(dāng)偏堿，因此加入培養(yǎng)基后需要重新調(diào)整pH。

4）將準(zhǔn)備好的Fluo-8,AM工作液加入細(xì)胞，加入量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。37℃或者室溫孵育20-60min。

【注（1）】：關(guān)于孵育的時間，如果首ci做實驗不能確定，建議先孵育30min,看熒光效果；如果細(xì)胞死亡較多，適當(dāng)縮短時間；如果熒光強度太弱，適當(dāng)延長時間。

【注（2）】：降低探針加載溫度可能會降低探針的區(qū)室化現(xiàn)象。

5）吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉(zhuǎn)運體抑制劑如2.5mM丙磺酸的緩沖液）替換，去除多余探針。

6）用適當(dāng)?shù)膬x器如激光共聚焦、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀等，用波長Ex/Em=490/520nm來進行檢測。

【注（1）】：Fluo-8,AM進入胞內(nèi)后，經(jīng)酯酶降解形成Fluo-8，并不是以供價結(jié)合的形式滯留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。因此不可對加載染料的活細(xì)胞進行固定處理，再進去Ca2+水平檢測。

注意事項

1）熒光染料均勻在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2）乙酰氧基甲酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環(huán)境放至室溫后在開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3）Fluo-8,AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管底、或管壁或管蓋內(nèi)，可在20-25℃溫育片刻至全部溶解后使用。

4）Fluo-8,AM第一次使用，建議儲存液現(xiàn)配現(xiàn)用，分裝成單次用量，嚴(yán)格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實驗效果，盡量在短時間內(nèi)使用。

5）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。