貨號(hào)： HG-ZL001

產(chǎn)品簡介：

質(zhì)粒殘留DNA檢測試劑盒通過對市場所用質(zhì)粒共有序列的分析，如：ColE1/pMB1/pBR322/pUC 來源的復(fù)制子，可以實(shí)現(xiàn)定量檢測樣品（如慢病毒、腺病毒、mRNA等）中各類質(zhì)粒DNA的殘留。本試劑盒利用TaqMan熒光探針原理，專一性強(qiáng)，靈敏度高，性能可靠，用于檢測各種生物制品中間品、半成品和成品中質(zhì)粒DNA殘留的專用試劑盒。配套我司樣品前處理試劑盒（貨號(hào)為HG-CL100）進(jìn)行樣品的前處理。 

試劑盒配套有質(zhì)粒定量參考品（已完成標(biāo)準(zhǔn)品溯源）。

 檢測范圍：4×10¹ copies/μL~4×10⁶ copies/μL 

換算公式：質(zhì)?？截悢?shù)（copies/μL）=6.02×10¹⁴×質(zhì)粒濃度（ng/μL）/（質(zhì)粒堿基數(shù)×660）

規(guī)格：

100 Reactions

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品儲(chǔ)存條件與有限期：

存儲(chǔ)條件見上表，有效期12個(gè)月。

適用機(jī)型（包括但不限于）：

◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480

需要準(zhǔn)備的耗材與設(shè)備：

實(shí)驗(yàn)前請準(zhǔn)備好下列耗材與設(shè)備：
◆1.5mL或2mL無菌低吸附離心管
◆ 與PCR儀適配的96孔qPCR板或八聯(lián)排管
◆ 1000μL，200μL，10μL無菌低吸附帶濾芯槍頭
◆ 熒光定量PCR儀
◆ 水浴鍋/金屬浴

◆ 離心機(jī)
◆ 震蕩器
◆ 各規(guī)格移液器（如1000μL，200μL，10μL，2.5μL等）
◆ 磁力架

實(shí)驗(yàn)步驟：

一、 樣品前處理

詳見樣品前處理試劑盒（貨號(hào)為HG-CL100）操作說明書。

二、 qPCR操作步驟

1. 定量參考品及NCS、NTC的制備
 1.1 定量參考品：即用型；

 1.2 NTC 的制備：100uL DNA稀釋液；

 1.3 NCS 的制備：取100μL DNA稀釋液與樣本一同進(jìn)行樣本前處理；

 1.4 加標(biāo)回收ERC：建議90uL樣品+10uL 定量參考品3，也可根據(jù)實(shí)際情況按照其他方式制備；

2. q-PCR 反應(yīng)液的制備和加樣
 2.1 根據(jù)所需檢測的標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品數(shù)量（一般做3個(gè)復(fù)孔），計(jì)算所需孔數(shù)：
       反應(yīng)孔數(shù) =（定量參考品 1~6 + 2 個(gè)陰性對照 NTC 和 NCS+ 待測樣品）×3
 2.2 根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需的 qPCR Mix 總量：
       qPCR Mix=（反應(yīng)孔數(shù) +2 或 3）× 20μL（2 或 3 為操作損失量）
 2.3 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按表 2 所示配制制 qPCR Mix。

qPCR Mix 配制表

3. 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示加樣（總體積30μL）：

各反應(yīng)孔加樣示例

4.實(shí)驗(yàn)需使用qPCR實(shí)驗(yàn)專用的八聯(lián)管或者96孔板進(jìn)行反應(yīng)，需去除反應(yīng)體系中的氣泡，并離心將液體離至管底準(zhǔn)備反應(yīng)。
5.反應(yīng)孔排版示例

96孔板排版示例

三、 qPCR反應(yīng)程序和參數(shù)設(shè)置

（以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例。）

1.創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)反應(yīng)板，點(diǎn)擊Select Fluorophores選擇熒光 FAM;在反應(yīng)板圖表中，選擇樣品孔，在 Sample Type 中下拉選擇Unknow，勾選熒光 FAM，Target Name命名為 ZL；輸入每個(gè)樣品的重復(fù)次數(shù)及 Sample Name。

2.在反應(yīng)板圖表中，選擇標(biāo)曲孔，在Sample Type中下拉選擇Standard，勾選熒光FAM，Target Name命名為E1ADNA；勾選熒光CY5，Target Name命名為SV40LTA-DNA；輸入每個(gè)稀釋梯度的重復(fù)次數(shù)及Sample Name。分別在STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6的Concentration一欄賦值為4E+06、4E+05、4E+04、4E+03、4E+02、4E+01（單位為copies/μL）。

3.點(diǎn)擊Run界面“Start Run”按鈕進(jìn)行PCR測定。

備注：反應(yīng)體積30μL。程序中60℃ 30s處設(shè)置為熒光收集；有些儀器不允許熒光收集步驟設(shè)置為30s或更短，使用ABI7000、AB7300及ABI7500時(shí)可改為 35s，其他設(shè)備可咨詢儀器廠家

四、 qPCR結(jié)果分析

以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例
1. 點(diǎn)擊資料分析視窗Quantitation，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、擴(kuò)增效率（Effect）、R²。
2. 在視窗Quantitation Data 中，SQ Mean 一欄可讀取無模板對照NTC、NCS、待測樣本的檢測值，單位為fg/μL。
3. 數(shù)據(jù)可靠性評估：
• 三個(gè)平行孔間Ct值差應(yīng)小于1.0，Ct值大于35的孔除外；
• 陰性對照NTC和NCS的CT值都應(yīng)大于標(biāo)曲最i低濃度的CT值或根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自身驗(yàn)證結(jié)果設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)；
• 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)R²≥0.98，擴(kuò)增效率85%~110%之間；
• ERC回收率在50%~150%之間（加標(biāo)回收率=ERC/(0.9*樣品+0.1*ST3)。

注意事項(xiàng)：

1. 本試劑盒已通過穩(wěn)定性（凍融等因素）的驗(yàn)證，無需分裝。

2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測樣品等）的配制環(huán)境需區(qū)分區(qū)域，不可在一個(gè)區(qū)域內(nèi)操作，配制人員需穿戴整齊，戴好口罩、手套和穿好潔凈服。

3. 注意在不同加樣步驟間及時(shí)更換吸頭，避免交叉污染，避免長時(shí)開蓋。

4. 試劑盒必須在有效期內(nèi)使用。

5. 試劑盒內(nèi)所有組分建議在低溫環(huán)境融化后使用。

6. 只有嚴(yán)格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證優(yōu)良檢測效果。

7. 盡量在當(dāng)天完成樣本前處理純化后立即進(jìn)行后續(xù)qPCR檢測，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

8. 最終的試驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)。

9. 公司只對試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。

10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。

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效期保障：嚴(yán)格把控產(chǎn)品質(zhì)量，確保試劑效期新鮮，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

專業(yè)技術(shù)支持：提供詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案和技術(shù)指導(dǎo)，幫助用戶優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，提高實(shí)驗(yàn)成功率。

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