亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

亞硝酸還原酶試劑盒 氮代謝

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

硝酸還原酶（NiR）是一類能催化亞硝酸鹽還原的酶，廣泛存在于微生物及植物體內(nèi)，是自然界氮循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，可以將亞硝酸鹽降解為 NO 或NH3，從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累，降低因亞硝酸鹽累積而造成的對生物體的毒害作用。

測定原理：

亞硝酸還原酶可將NO2—還原為NO，使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的 NO —減少，即540nm 處吸光值的變化可反應(yīng)亞硝酸還原酶的活性。

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 12ml 蒸餾水溶解。

試劑三：液體 12ml×1 瓶，4℃保存。（如出現(xiàn)沉淀可以 70-80℃加熱溶解）

試劑四：液體 25ml×1 瓶，4℃避光保存。（如出現(xiàn)沉淀可以 70-80℃加熱溶解）工作液：臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以 1:1 的比例混合。

自備儀器和用品：

天平、研缽、可見分光光度計、水浴鍋、低溫離心機(jī)、1ml 玻璃比色皿。

酶液提取：

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 10000g， 4℃離心 10min，取上清置于冰上待測。

測定操作表：

計算公式：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.3594x + 0.0072，R2 = 0.9997；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/ml），y 為吸光值（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）。

按照蛋白含量計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h /mg prot）= [A 空白管-(A 測定管-A 對照管)-0.0072]÷1.3594×V 標(biāo)÷（V 樣×Cpr）÷T = 1.47×（A

空白管-A 測定管+A 對照管-0.0072）÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h/g 鮮重）=[A 空白管-(A 測定管-A 對照管)-0.0072]÷1.3594×V 標(biāo)÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T = 1.47×

（A 空白管-A 測定管+A 對照管-0.0072）÷W

按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活單位定義：每 104 個細(xì)胞每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h /104 cell）= [A 空白管-(A 測定管-A 對照管)-0.0072]÷1.3594×V 標(biāo)÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）

÷T = 1.47×（A 空白管-A 測定管+A 對照管-0.0072）÷細(xì)胞數(shù)量

V 標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.2ml；V 樣：體系中加入樣本體積，0.1ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質(zhì)量，g

注意事項：

配制好的工作液 3 天內(nèi)使用完。

若吸光值超過 3，將上清液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤偌尤牍ぷ饕猴@色，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

嚴(yán)格控制顯色時間，否則會對結(jié)果有影響。

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為 0.03μmol/ml-1.5μmol/ml。

A 空白管-（A 測定管-A 對照管）線性范圍為 0.02-3。

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