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【飛諾美色譜】臨床樣本中類固醇激素的SLE前處理方案

閱讀:235      發(fā)布時間:2024-12-11
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類固醇激素,又稱甾體激素,調(diào)節(jié)人體多種機(jī)能,在臨床診斷發(fā)揮著重要的作用。在前面的推文中,我們已經(jīng)分享過一種關(guān)于臨床檢測中19種類固醇激素的反相SPE前處理及相應(yīng)的LC-MS/MS分析方案,這周我們?yōu)榇蠹曳窒砹硪环N前處理方案:固相支撐液液萃?。⊿olid-Supported Liquid Extraction, SLE)方法在其中的應(yīng)用。


SLE操作步驟如下:

步驟操作
樣品預(yù)處理200µL血清樣本與200µL pH為6的乙酸銨水溶液混合
上樣在Novum PRO SLE, MAX 96孔板(Part No.: 8E-S539-5GA)中加入400µL預(yù)處理之后的樣品,適當(dāng)施壓待樣品浸入填料,5分鐘后進(jìn)行洗脫
洗脫1900µL二氯甲烷或者乙酸乙酯(必要時適當(dāng)施壓)
洗脫2900µL二氯甲烷或者乙酸乙酯(必要時適當(dāng)施壓)
氮吹濃縮45℃
復(fù)溶100µL 0.5mM的氟化銨水溶液/甲醇(60:40, V:V)復(fù)溶




PS: pre-spiked samples

PoS: post-spiked samples




圖6 Kinetex C18分離類固醇相關(guān)異構(gòu)體總離子流圖




圖7 部分化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線


表6 標(biāo)準(zhǔn)曲線,LLOQ和S/N結(jié)果匯總






圖8 部分化合物L(fēng)LOQ限度譜圖示例


表7 回收率及準(zhǔn)確度結(jié)果




表8 精密度,基質(zhì)效應(yīng)和方法回收率結(jié)果




Kinetex 2.6µm C18色譜柱在正離子和負(fù)離子模式下在8min內(nèi)實現(xiàn)了對類固醇相關(guān)異構(gòu)體的良好分離(圖6)。使用二氯甲烷洗脫時,除17羥基孕烯醇酮和DHEAS外,其他組分線性良好,R2>0.99;當(dāng)使用乙酸乙酯洗脫時,所有組分R2>0.98(圖7、表6)。對于準(zhǔn)確度而言,使用二氯甲烷洗脫時,除17羥基孕烯醇酮和DHEAS外都在80%~112%之間,而使用乙酸乙酯洗脫時候,所有組分準(zhǔn)確度都在91%~118%之間(表7)。


此外,使用二氯甲烷洗脫時,回收率在13%~87%之間(表7),其中18羥基皮質(zhì)酮(13%)、醛固酮(21%)、孕酮(28%)、皮質(zhì)醇(24%)和可的松(52%)回收率均較低。在使用乙酸乙酯洗脫時,除DHEAS外,所有組分回收率均在84%~110%之間。本次研究中發(fā)現(xiàn)DHEAS在SLE方法下基本無回收,建議使用反相SPE方式進(jìn)行前處理。


本方案中所開發(fā)的SLE方法簡便有效可重復(fù)性強(qiáng),所用到Novum PRO SLE, MAX 96孔板可實現(xiàn)快速、高通量的樣品前處理。分析中用到的Kinetex 2.6µm C18色譜柱也可在8分鐘內(nèi)對相關(guān)類固醇化合物進(jìn)行有效分離,實現(xiàn)LC-MS/MS方法的準(zhǔn)確定量。

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