摘要：本文旨在介紹一種基于ICH Q14指南的有關(guān)物質(zhì)分析方法開(kāi)發(fā)流程，該方法利用ACD/AutoChrom 軟件和統(tǒng)計(jì)學(xué)工具來(lái)開(kāi)發(fā)HPLC分析方法和驗(yàn)證分析方法的耐用性范圍。通過(guò)案例研究某主成分及其雜質(zhì)的分析，展示了如何確保方法的專屬性、準(zhǔn)確度和靈敏度及確定合理的耐用性范圍。
引言
在藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中，有關(guān)物質(zhì)的分析是確保藥品質(zhì)量的關(guān)鍵步驟。ICH Q14指南提供了一個(gè)關(guān)于方法開(kāi)發(fā)的框架，要求分析方法必須滿足專屬性、準(zhǔn)確度和靈敏度等要求。本文通過(guò)某主成分的案例，詳細(xì)描述了按照ICH Q14要求如何利用ACD / AutoChrom 軟件和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證HPLC分析方法。
方法開(kāi)發(fā)范圍及目的
目的：某主成分是一種原料藥，本研究旨在開(kāi)發(fā)一種分析方法，用于檢測(cè)該主成分中的已知和未知雜質(zhì)，確保產(chǎn)品質(zhì)量。
開(kāi)發(fā)范圍：包括Imp. 1、Imp. 2、Imp. 3、Imp. 4、Imp. 5、Imp. 6等已知雜質(zhì)以及未知雜質(zhì)和總雜質(zhì)。
分析目標(biāo)概況
方法開(kāi)發(fā)過(guò)程
知識(shí)準(zhǔn)備和風(fēng)險(xiǎn)分析：
基于對(duì)化學(xué)結(jié)構(gòu)、色譜知識(shí)及ACD/Labs軟件對(duì)該產(chǎn)品的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分析方法開(kāi)發(fā)，確保各組分的專屬性、靈敏度及準(zhǔn)確性。
PH的確定：利用ACD/Labs軟件預(yù)測(cè)該主成分及各雜質(zhì)的log D
各組份在pH 0-11范圍內(nèi)log D均大于1，無(wú)保留的風(fēng)險(xiǎn)，且不受pH影響，考慮到大多數(shù)色譜柱的pH耐用性，pH確定為2.0~8.0范圍。
檢測(cè)波長(zhǎng)的確定：使用DAD，獲得各組份的DAD數(shù)據(jù)，如下圖。
通過(guò)DAD圖進(jìn)行對(duì)比，選擇230nm波長(zhǎng)作為該分析方法的檢測(cè)波長(zhǎng)。
分析方法篩選部分：
色譜柱的選擇：由于各組份主要結(jié)構(gòu)差異為苯環(huán)上取代基，本次篩選了Inertsil ODS-3，Welch Xtimate C18, Phenomenex Kinetex-BiPhenyl，最終確定了Phenomenex Kinetex-BiPhenyl 作為本方法中的色譜柱。
流動(dòng)相的選擇：弱洗脫，本方法中pH的選擇范圍在2.0-8.0，經(jīng)過(guò)篩選，選擇0.1%磷酸溶液為弱洗脫。強(qiáng)洗脫，部分雜質(zhì)的Log D約為5，經(jīng)過(guò)篩選選擇及乙腈作為流動(dòng)相，梯度洗脫。
篩選獲得的方法中發(fā)現(xiàn)有一個(gè)未知工藝雜質(zhì)與不同已知雜質(zhì)有較多的分離問(wèn)題，是本方法的主要的專屬性方面的風(fēng)險(xiǎn)。
色譜方法優(yōu)化和初步鑒定：
1、使用一臺(tái)儀器（A品牌），設(shè)計(jì)兩個(gè)梯度，三個(gè)柱溫（25℃、30℃、35℃）的兩因素梯度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
洗脫梯度 1：
洗脫梯度 2：
根據(jù)以上條件得到的圖譜，使用 AutoChrom 軟件進(jìn)行建模，模型如下：
從模型分析，隨著柱溫的升高以及更緩（增加一個(gè)梯度拐點(diǎn)）的洗脫梯度，未知雜質(zhì)出峰位置會(huì)相對(duì)主峰、Imp.2和 Imp.3發(fā)生較大后移。在柱溫40℃及以下洗脫梯度（表一）時(shí)，未知雜質(zhì)出峰在Imp.3后，分離較好（軟件中顯示分離度：4.4），且柱溫耐用性范圍較寬（可達(dá)±5℃），故以柱溫40℃和表一梯度作為初步確認(rèn)的中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)條件，在相同品牌不同設(shè)備編號(hào)的儀器上進(jìn)行方法確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。
表一：梯度表（柱溫40℃）
2、使用中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)條件在相同品牌不同設(shè)備編號(hào)的儀器上進(jìn)行重現(xiàn)，圖譜如下：
不同設(shè)備編號(hào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表：
解析：儀器2與儀器3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Imp.3與未知雜質(zhì)實(shí)際分離度和軟件模擬結(jié)果重現(xiàn)度高，而儀器1相對(duì)另外兩臺(tái)儀器，主峰保留時(shí)間提前了近兩分鐘，同時(shí)Imp.3與未知雜質(zhì)分離最差。其原因可能與泵和管路的差異有關(guān)。
3、為了確保后續(xù)方法在不同儀器能有較好的重現(xiàn)性，在分離最差的儀器（儀器1）上重新進(jìn)行梯度溫度雙因素建模，設(shè)計(jì)洗脫梯度和三個(gè)柱溫（25℃、35℃、45℃）進(jìn)行兩因素實(shí)驗(yàn)以建立數(shù)據(jù)模型， 洗脫梯度如下表：
洗脫梯度 1：
洗脫梯度 2：
根據(jù)以上條件得到的圖譜進(jìn)行建模，模型如下：
基于儀器1上的建立的新模型，并比較在原方法開(kāi)發(fā)的儀器上建立的模型，重新調(diào)整中心點(diǎn)的位置到柱溫35℃及以下洗脫梯度（表二）。此時(shí)未知雜質(zhì)與Imp.3分離較好（軟件預(yù)測(cè)分離度：5.2），且柱溫耐用性范圍較寬（可達(dá)±5℃），故以柱溫35℃和表二梯度作為中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)條件，在儀器1上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
表二：梯度表（柱溫35℃）
4、使用中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)條件在相同品牌不同設(shè)備編號(hào)的儀器上進(jìn)行重現(xiàn)
儀器1上中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)加雜溶液（主成分：1mg/ml，各雜質(zhì)：1μg/ml）圖譜如下：
解析：經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Imp.3 與未知雜質(zhì)實(shí)際分離度為：5.7，和軟件模擬重現(xiàn)度好，結(jié)合原模型獲得的空間，調(diào)整中心點(diǎn)，確定使用該梯度條件及柱溫為 35℃。
方法耐用性范圍的確定：
利用AutoChrom 軟件進(jìn)行耐用性預(yù)測(cè)，并使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（JMP）對(duì)方法參數(shù)的范圍和相互作用進(jìn)行探索，建立耐用性空間。
下表展示了選取的變化因素及高低水平的設(shè)置，在AutoChrom 軟件中預(yù)測(cè)出如下條件變化產(chǎn)生243個(gè)實(shí)驗(yàn)組合的最小分離度。
利用JMP對(duì)方法參數(shù)的范圍和相互作用進(jìn)行探索，將AutoChrom 軟件中模擬出243個(gè)實(shí)驗(yàn)的最小分離度導(dǎo)入統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（JMP），進(jìn)行處理得到如下結(jié)果：
解析：由預(yù)測(cè)值-實(shí)際值圖可以得出，本數(shù)據(jù)模型RSq值為0.95，模型準(zhǔn)確度較高，故AutoChrom 軟件模擬預(yù)測(cè)出的243個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有參考意義，上表設(shè)定的條件范圍為耐用性空間范圍；由預(yù)測(cè)刻畫(huà)器圖可以看出，有機(jī)相起始比例、有機(jī)相終止比例、柱溫和流速對(duì)于分離度有影響，其中柱溫的影響是顯著的，由模型數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果可以初步確定本方法在柱溫35℃，流速為1.2ml/min，洗脫梯度為如下表格。
在此數(shù)據(jù)模型下，探索統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（JMP）對(duì)于方法開(kāi)發(fā)階段的幫助，在預(yù)測(cè)刻畫(huà)器中，使用設(shè)計(jì)空間刻畫(huà)器，設(shè)置我們所需要達(dá)到的低分離度，可以得到我們滿足分離要求的空間，由于本方法模型數(shù)據(jù)均符合分離要求，在此設(shè)計(jì)一個(gè)較大的分離度要求（分離度≥2.5）
解析：在設(shè)計(jì)空間刻畫(huà)器中可以看到，模型數(shù)據(jù)中滿足分離度要求（分離度≥2.5）的條件占比在97.56%，如需找到一空間使所有分離度均≥2.5，可繼續(xù)內(nèi)移。
解析：在內(nèi)移至所有條件均滿足分離度要求（分離度≥2.5）時(shí)，此時(shí)的方法為耐用性范圍為：有機(jī)相起始比例（28±1%）、有機(jī)相終止比例（32±1%）、梯度洗脫時(shí)間（25±1min）、柱溫（30~37℃）及流速（1.2±0.1ml/min）；在此基礎(chǔ)上將限值發(fā)送到模擬器對(duì)耐用性范圍進(jìn)行驗(yàn)證。
解析：由模擬器模擬后得到，耐用性范圍與設(shè)計(jì)空間刻畫(huà)器一致。
從實(shí)際出發(fā)，以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)來(lái)論證本方法耐用性空間，在對(duì)分離影響較大的各個(gè)因素中取邊界點(diǎn)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)出12針處于耐用性空間邊界的12個(gè)色譜條件，如下表格：
并且在儀器1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下：
解析：在耐用性空間邊界點(diǎn)的12個(gè)色譜條件下，Imp.3與未知雜質(zhì)分離均較好，主峰及其他已知雜質(zhì)與相鄰峰分離也較好。
為了進(jìn)一步確保此方法在不同品牌儀器間差異，再?gòu)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)軟件設(shè)計(jì)的12個(gè)色譜條件中選擇序號(hào)1、2、3、7、9和10色譜條件（每個(gè)因素的高低水平都各有三個(gè)實(shí)驗(yàn)條件，相當(dāng)于也是均勻分布在耐用空間上的6個(gè)點(diǎn)），在不同品牌儀器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，圖譜如下：
解析：在不同品牌儀器中，6個(gè)色譜條件下，主峰和已知雜質(zhì)與相鄰峰分離均較好，本方法耐用性空間建立成功。
耐用性范圍為：有機(jī)相起始比例（28±1%）、有機(jī)相終止比例（32±1%）、梯度洗脫時(shí)間（25±1min）、柱溫（35±5℃）及流速（1.2±0.1ml/min）。
結(jié)論
本研究成功開(kāi)發(fā)了一種基于ICH Q14的HPLC分析方法，用于某主成分及其雜質(zhì)的檢測(cè)。利用ACD/ AutoChrom 軟件和統(tǒng)計(jì)學(xué)工具，優(yōu)化了色譜條件，確保了方法的專屬性、準(zhǔn)確度和靈敏度，并建立了方法的耐用性空間。
Kinetex Biphenyl
• 出色的分離能力
• 耐用且可靠
• 100 % 水溶液穩(wěn)定
具備 C18 無(wú)法提供的選擇性！
不僅僅只是高性能和強(qiáng)保留，Kinetex Biphenyl 還擁有傳統(tǒng) C18 色譜柱無(wú)法媲美的能力?？商峁┚哂泄潭ㄏ嗟暮?殼顆粒所帶來(lái)的高性能，這種固定相能夠?yàn)榉聪喾椒ㄩ_(kāi)發(fā)中改善選擇性的優(yōu)選。使用 Kinetex Biphenyl 色譜柱可增強(qiáng)保留能力，獲取更高的靈敏度和整體結(jié)果；尤為適合芳香族化合物的分析。
芳香族 π-π 相互作用
在聯(lián)苯基的芳環(huán)和目標(biāo)分子的芳環(huán)以及 π 電子之間
疏水性相互作用
發(fā)生在 Biphenyl 配體的碳骨架與目標(biāo)分析物之間
弱離子或偶極-偶極相互作用
雙環(huán)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的高電子密度能夠發(fā)揮類似于弱陽(yáng)離子交換劑的作用，從而增強(qiáng)堿性分析物的保留能力。
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