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體積排阻色譜(SEC):大分子分離的“分子篩”奧秘

閱讀:49      發(fā)布時(shí)間:2025-3-13
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你是否好奇科學(xué)家如何精確分析多肽、蛋白質(zhì)、聚合物甚至病毒顆粒的分子量?答案就藏在**體積排阻色譜(SEC)**的奇妙世界中!今天,讓我們揭開(kāi) SEC 固定相的神秘面紗,探索它如何成為實(shí)驗(yàn)室的“分子尺子"!


SEC 的核心:尺寸決定命運(yùn)!


SEC 的原理簡(jiǎn)單卻強(qiáng)大——大分子先出,小分子后出!固定相由多孔填料組成,分子像“賽跑選手"一樣穿過(guò)孔道:



大分子因體積過(guò)大,直接被“拒之門外",快速洗脫(排阻體積)。


小分子能鉆進(jìn)孔隙“迷宮",洗脫時(shí)間更長(zhǎng)(滲透體積)。


下圖所示為 SEC 色譜圖中化合物尺寸與洗脫的關(guān)系。一個(gè)常見(jiàn)的誤解是 SEC 基于分子量分離分子。大多數(shù)情況下確實(shí)是這樣,分子量較大的分析物通常會(huì)先洗脫。不過(guò),更準(zhǔn)確的說(shuō)法是 SEC 基于流體力學(xué)體積分離分子,即分子在流動(dòng)相或溶劑中的有效大小。



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SEC 通常分為兩種不同的類型:



凝膠過(guò)濾色譜法(GFC):使用水溶液作為流動(dòng)相


凝膠滲透色譜法(GPC):使用有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相


雖然 SEC 包括 GFC 和 GPC 兩種不同類型的分析,但大多數(shù)科學(xué)家并不對(duì)其進(jìn)行區(qū)分??茖W(xué)家經(jīng)常交換使用 GPC 和SEC。他們經(jīng)常會(huì)稱自己的工作為水相 GPC/SEC 或非水相 GPC/SEC,而不是 GPC 或 GFC。


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固定相:硅膠 VS 聚合物,誰(shuí)主沉浮?


SEC 色譜柱的固定相可以是硅膠基質(zhì)或聚合物基質(zhì)。硅膠基質(zhì)色譜柱與極性基團(tuán)(通常為二醇)鍵合,以防止與分析物產(chǎn)生離子相互作用。聚合物基質(zhì)色譜柱使用疏水性或極性指數(shù)與樣品相似的聚合物填料??梢詮南卤淼恼碇邪l(fā)現(xiàn),兩種固定相各有各的優(yōu)劣勢(shì)。


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按照上述對(duì)比,我們可以大致得出一個(gè)寬泛的結(jié)論:高分辨率快速分離、以及常規(guī)分析可以優(yōu)選硅膠基質(zhì),且緩沖液+硅膠柱的搭配更適合親水性生物分子(如蛋白);對(duì)于極-端 pH 或有機(jī)溶劑條件,以及分析超大分子(如病毒顆粒、合成高分子)的時(shí)候,聚合物基質(zhì)更優(yōu)。


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實(shí)戰(zhàn)技巧:如何玩轉(zhuǎn) SEC?


SEC 填料為全多孔,通過(guò)不同孔徑進(jìn)行分離。孔的體積越大,SEC 填料的分離能力越強(qiáng)。排阻體積(Vo)對(duì)應(yīng)固定相孔排除的化合物洗脫所需的流動(dòng)相體積。總滲透體積(Vt)是尺寸足夠小、可以進(jìn)入固定相孔的化合物洗脫所需的流動(dòng)相體積?;衔锓蛛x發(fā)生在排阻體積與總滲透體積之間。這個(gè)體積用填料的總孔體積表示(參見(jiàn)下圖)。最終,SEC 填料的孔徑將決定色譜柱的排阻范圍,或排阻體積與滲透體積之間的對(duì)應(yīng)分子量范圍。


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基于上述原理,在使用 SEC 的過(guò)程中,我們可以利用以下實(shí)用攻略:


01

串聯(lián)色譜柱:


同孔徑串聯(lián)(如雙 50? 柱)→通過(guò)延長(zhǎng)柱長(zhǎng)提高理論塔板數(shù),增強(qiáng)對(duì)分子量接近組分的分離分辨率。


不同孔徑串聯(lián)(如 50?+1000?)→擴(kuò)展分離分子量范圍,兼顧小分子片段與大分子聚集體的同步檢測(cè)。注意需要將大孔徑柱置于前端,避免小孔徑柱堵塞風(fēng)險(xiǎn)。


02

選擇合適的填料孔徑:

需確保目標(biāo)分子處于填料的線性分離區(qū)間(介于排阻極限與滲透極限之間),按照核心公式(經(jīng)驗(yàn)法則):


球形分子(如蛋白質(zhì)、抗體):

孔徑(?)≈ 分子量(kDa)× 1.5


例:150 kDa 單抗 → 200-300 ?。雖然選擇 200? 和 300? 都是滿足排阻范圍的,但是 200? 可以在保證聚集體分離的前提下,帶來(lái)更好的片段分離能力,實(shí)現(xiàn)更全面的質(zhì)量監(jiān)控。


線性/柔性分子(如核酸、多糖、PEG):

孔徑(?)≈ 分子量(kDa)× 2.0


例:5,000 nt mRNA ≈ 1,500 kDa → 700-1,000 ?。對(duì)于 5000 nt 以下的 mRNA,選擇 700 ?(貼近計(jì)算值下限),能夠帶來(lái)更高的分辨率。


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Phenomenex SEC 產(chǎn)品亮點(diǎn)


Biozen dSEC-2 & dSEC-7:通過(guò)生物惰性系統(tǒng)與親水化硅膠填料的協(xié)同設(shè)計(jì),為生物藥關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)分析提供更靈敏、更穩(wěn)定的分離平臺(tái)。


Yarra & Biosep:專為多肽,蛋白質(zhì)分離而生。


Polysep:聚合物基質(zhì)搭配 GFC 分析,輕松應(yīng)對(duì)多糖等復(fù)雜樣本。


Phenogel:聚合物柱的“多面手",覆蓋從 PS(聚苯乙烯)到 PEG(聚乙二醇)的全場(chǎng)景 GPC 需求。


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未來(lái)展望

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隨著生物藥與復(fù)雜制劑(mRNA/AAV/ADC)的爆發(fā)式增長(zhǎng),高通量、高精度 SEC 平臺(tái)已成為研發(fā)質(zhì)控的核心剛需。Phenomenex SEC 色譜技術(shù)持續(xù)賦能,為生物醫(yī)藥“關(guān)鍵質(zhì)量屬性"提供更優(yōu)異的分離保障!




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