隨著生物制藥的迅猛發(fā)展，凍干已經(jīng)成為一種有效的技術(shù)來解決制藥過程中存在的化學(xué)，物理，生物的不穩(wěn)定性問題。結(jié)合凍干本身的技術(shù)特點，凍干產(chǎn)品開發(fā)的最終目的是要保證產(chǎn)品質(zhì)量的同時利用最短的生產(chǎn)時間來節(jié)約成本。產(chǎn)品的質(zhì)量包括安全，高效，穩(wěn)定，較短的復(fù)水時間，優(yōu)雅的蛋糕外觀等。

凍干是一個復(fù)雜的傳熱傳質(zhì)的過程，如果處理不當(dāng)，在冷凍以及干燥過程中，樣品中的活性成分以及賦形劑會發(fā)生一些物理或化學(xué)變化，從而破壞了各自原有的功能特性，因此需要進(jìn)行采取合理的方法來加以解決，從而達(dá)到凍干制劑開發(fā)的最終目的。

預(yù)凍階段

樣品溶液隨著溫度的降低，含有的水先凍結(jié)成冰晶析出，剩余的溶液的濃度越來越大，形成最大濃縮凍結(jié)液，溶質(zhì)和溶劑分離，在這個階段，水分的結(jié)晶會導(dǎo)致蛋白濃度增加，賦形劑濃度增加，離子強度增加，粘度增加，賦形劑結(jié)晶或相分離，pH改變等，這些可能會影響到蛋白的穩(wěn)定性。

干燥

結(jié)晶的冰通過升華去除，未結(jié)晶的冰通過解吸附去除，樣品中的水分含量是一個動態(tài)變化的過程，樣品會面臨水分去除產(chǎn)生的應(yīng)力，即干燥應(yīng)力，導(dǎo)致配方中成分發(fā)生一定的變化。

儲存

較低的水分含量，溫度的偏差，賦形劑的相分離。

常用賦形劑的功能性及物理狀態(tài)

表1：常用賦形劑的功能性及期望的物理狀態(tài)

然而在凍干過程中，活性成分以及賦形劑之間具有復(fù)雜的相互影響，不同的濃度，不同的比例，不同的種類等都會引起一些結(jié)構(gòu)狀態(tài)的變化，從而導(dǎo)致其原本的功能喪失，比如：若海藻糖結(jié)晶會導(dǎo)致保護(hù)功能的喪失；若甘露醇變?yōu)闊o定形結(jié)構(gòu)，會降低產(chǎn)品的關(guān)鍵溫度，并且無定形態(tài)具有較差的穩(wěn)定性，喪失了其作為填充劑的功能；若緩沖液成分結(jié)晶，會導(dǎo)致pH值的變化，緩沖功能喪失，蛋白穩(wěn)定性受到影響。因此研究各個配方組分之間的相互影響作用對確保最終產(chǎn)品的質(zhì)量具有較大的作用。

01.糖類和填充劑功能性之間的相互影響

雙糖是常用的凍干保護(hù)劑，如蔗糖，海藻糖，雙糖與蛋白的最小質(zhì)量比通常為3:1到5:1，但是糖類通常會降低樣品的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度，使得凍干通常會花費較長的時間，因此會將糖類跟具有較高共晶融化溫度的填充劑結(jié)合使用，如甘露醇，甘氨酸，這樣可以讓樣品在較高的溫度下進(jìn)行干燥，形成良好的外觀結(jié)構(gòu)，節(jié)約干燥時間(Tang and Pikal, Pharm Res. 2004; Johnson, Kirchhoff and Gaud, J Pharm Sci. 2001)。

市面上有一些藥品就是以這種方式開發(fā)的，如阿必魯泰（Tanzeum），是一種融合蛋白，糖尿病患者用藥，配方中含海藻糖以及甘露醇成分；沙格司亭凍干粉注射劑（Leukine）是一種源于酵母的重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF），能夠刺激各種免疫細(xì)胞的生長和活化，已用于白血病患者降低感染風(fēng)險，配方中含蔗糖和甘露醇成分；魯磨西替（Lumoxiti）是一種單抗抗癌制劑，配方中含蔗糖和甘氨酸成分。

圖1：阿必魯泰（Tanzeum）

這種結(jié)合的有效性取決于：在凍干和儲存過程中兩種賦形劑的物理形態(tài)；正確的比例以及凍干條件。理想狀態(tài)下，整個過程中糖類應(yīng)當(dāng)處于無定形狀態(tài)，起到穩(wěn)定劑的作用；填充劑在干燥之前應(yīng)當(dāng)充分結(jié)晶，使得樣品具有良好的結(jié)構(gòu)強度，提高關(guān)鍵產(chǎn)品溫度，縮短凍干時間。

Part.1 蔗糖對甘氨酸填充劑結(jié)晶的抑制影響

實驗通過將蔗糖和甘氨酸以不同比例（從1:9到9:1）溶解于水中，分別在15℃退火1h 和不進(jìn)行退火，凍干后樣品通過近紅外光譜測定甘氨酸的結(jié)晶度。觀察到當(dāng)蔗糖：甘氨酸＞4時，甘氨酸失去了其填充劑的功能（Bai et al., J Pharm. Sci. 2004）。

圖2：蔗糖對甘氨酸填充劑功能的影響

Figure plotted from data given in Bai et al., J PHarm. Sci. 2004

Part.2 海藻糖+甘露醇功能性的相互影響

不同比例的海藻糖+甘露醇溶液進(jìn)行凍干，二者的比例決定了各自的物理形態(tài)以及其發(fā)揮的功能性（Jena, Suryanarayanan and Aksan, Pharm Res. 2016）。

表2：海藻糖和甘露醇比例對其物理形態(tài)及功能性影響

海藻糖在酸性條件下不會水解，具有較高的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度，但是具有結(jié)晶傾向性。當(dāng)凍干的條件利于海藻糖無定形形態(tài)存在時，會抑制甘露醇的結(jié)晶，相反，當(dāng)凍干的條件利于甘露醇結(jié)晶形態(tài)存在時，會促進(jìn)海藻糖二水合物的產(chǎn)生，失去其無定形結(jié)構(gòu)，二者相互抑制，因此需要確定最佳的一個比例條件，確保各自能發(fā)揮本身應(yīng)起的作用。從實驗結(jié)果來看，當(dāng)海藻糖和甘露醇比例為1:3時，甘露醇保持其原有的晶體形態(tài)，海藻糖保持其原有的無定形態(tài)，在配方中分別起填充劑和穩(wěn)定劑的功能（Sundaramurthi and Suryanarayanan, J. Phys. Chem. Letters 2010; Sundaramurthiet. al., Pharm. Res. 2010; Sundaramurthi and Suryanarayanan, Pharm. Res. 2010;）。

Part.3 海藻糖、API（BSA）和甘露醇的相互影響

海藻糖—BSA---甘露醇凍干混合液，海藻糖和BSA的不同比例對海藻糖物理形態(tài)的影響，甘露醇濃度固定在10%W/W，總的固形物含量22%W/W（Jena et al., Int J. Pharm.2019）。

表3：BSA和海藻糖比例對海藻糖物理形態(tài)影響

實驗結(jié)果表明

當(dāng)BSA與海藻糖比例為10:1時，海藻糖能起到良好的穩(wěn)定劑作用。

Part.4 蔗糖和甘露醇的相互影響

除了抑制作用外，糖可能會改變甘露醇的存在形式，甘露醇有幾種形態(tài)存在，無水甘露醇（α-，β-，δ-）和半水合物-MHH。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)蔗糖：甘露醇為1:4時，蔗糖會保留無定形態(tài)，甘露醇為結(jié)晶態(tài)（部分以MHH形式存在），MHH甘露醇在最終的干燥產(chǎn)品中是不希望存在的，在儲存的過程中，MHH會脫水，釋放水分，水分可能會跟產(chǎn)品中的其他組分進(jìn)行反應(yīng)，無定形狀態(tài)的蔗糖吸收水分后會發(fā)生結(jié)晶，從而失去了對活性成分的保護(hù)功能（Thakral, Sonjeand Suryanarayanan, Int J. Pharm. 2020）。

因此，綜上所述，開發(fā)穩(wěn)定的凍干產(chǎn)品配方，并達(dá)到期望的產(chǎn)品質(zhì)量屬性，需要正確地選擇賦形劑的濃度，包括糖與填充劑的比例，蛋白與糖的比例，并且需要對凍干條件進(jìn)行優(yōu)化。

02.API/賦形劑對緩沖液功能性的影響

緩沖液需要加入到溶液中進(jìn)行pH的控制。常見的緩沖液包括磷酸鈉緩沖液，磷酸鉀緩沖液，組氨酸緩沖液，tris 緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，琥珀酸鹽緩沖液等。凍干產(chǎn)品緩沖液的選擇需要考慮蛋白的pKa以及緩沖液組分的結(jié)晶傾向，如磷酸鈉緩沖液中，酸性的磷酸二氫一鈉是無定形態(tài)；堿性的磷酸氫二鈉在凍結(jié)過程中會結(jié)晶成Na?HPO?·12H?O，導(dǎo)致凍結(jié)濃縮液的pH降低，失去了緩沖液的功能，因此緩沖液成分的結(jié)晶往往是不期望的。

Part.1 緩沖液，蛋白，糖之間的相互影響

有實驗研究了10mM 磷酸鈉緩沖液，100mM 磷酸鈉緩沖液，含5% w/w的纖維二糖，纖維二糖，在低pH下不會水解，不會結(jié)晶（通過在凍結(jié)過程中測定其pH值以及使用原位X射線衍射儀對結(jié)晶組分進(jìn)行鑒定）以及100mM 磷酸鉀緩沖液三種緩沖液與纖維二糖，蛋白之間的相互影響，如下表所示（Thorat, Munjal, Geders and Suryanarayanan, J. Control Rel.2020）——

表4：緩沖液、糖及蛋白成分對pH變化的影響

樣品中活性成分蛋白、糖與緩沖液之間具有協(xié)同作用，蛋白可以抑制緩沖液結(jié)晶，使其保持無定形狀態(tài)，緩沖液反過來可以維持特定的pH值，增加蛋白的穩(wěn)定性；一定濃度的糖可以抑制緩沖液的結(jié)晶，保持其無定形態(tài)，從而維持特定的pH值，提高蛋白穩(wěn)定性。

Part.2 甘氨酸對磷酸鈉緩沖液結(jié)晶以及pH變化的影響

表5：甘氨酸對磷酸鈉緩沖液結(jié)晶以及pH變化的影響

在10 mM緩沖液中，甘氨酸濃度越高，pH值變化越明顯，另外通過用同步X射線衍射法監(jiān)測溶質(zhì)結(jié)晶程度，磷酸鹽緩沖液對甘氨酸結(jié)晶具有濃度依賴性抑制作用，20%W/V甘氨酸和50-200mM緩沖液，緩沖液濃度越高，抑制作用越強，并且在-20℃進(jìn)行退火處理，能夠增強甘氨酸的結(jié)晶度。pH的改變能夠引起蛋白凝聚，可以通過降低緩沖液濃度，使用不結(jié)晶的緩沖液，通過蛋白，糖來抑制緩沖液結(jié)晶，并且某些蛋白本身就具有pH緩沖的功能（Pikal-Cleland et al., J. Pharm. Sci. 2002；Varshney et al., Pharm. Res. 2007；Thorat, Munjal, Geders and Suryanarayanan, J. Control Rel. 2020; Sundarmurathi and Suryanarayanan, J. Phys. Chem. B. 2011; Gokarnet al., J. Pharm. Sci. 2008）。

03.總結(jié)

凍干配方成分之間具有復(fù)雜的相互作用，某些組分可以通過改變其他組分的相行為來影響其功能性，必須正確選擇配方中賦形劑的濃度，使得每種成分能夠維持其最佳的物理形態(tài)，發(fā)揮應(yīng)有的功能性。

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