握體外抗原抗體反應(yīng)的特點和影響因素；
掌握經(jīng)典的體外抗原抗體反應(yīng)的原理、方法和應(yīng)用。
*節(jié) 免疫血清的制備
免疫血清的制備是一項常用的免疫學(xué)實驗技術(shù)。價、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑（如用于制備免疫標(biāo)記抗體等），也可供特異性免疫治療用。免疫血清的效價高低取決于實驗動物的免疫反應(yīng)性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強的抗原刺激高應(yīng)答性的機體，常可獲得價的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時，則需同時加用佐劑以增強抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決于免疫用抗原的純度。因此，如欲獲得高特異性的免疫血清，必須予先純化抗原。此外，抗原的劑量、免疫途徑及注射抗原的時間間隔等，也是影響免疫血清效價的重要因素應(yīng)予重視。
基本原理 具有免疫原性的抗原可刺激機體相應(yīng)B細(xì)胞增殖、分化形成漿細(xì)胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細(xì)胞克隆所識別，因此由某一抗原刺激機體后產(chǎn)生的抗體，實際上為針對該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物（即多克隆抗體）。
本實驗以弗氏*佐劑（FCA）乳化的抗原（人IgG）為抗原，來制備家兔抗人IgG免疫血清。要求學(xué)生初步學(xué)會免疫原和佐劑的制作及免疫血清制備的基本方法，了解其意義和應(yīng)用，熟悉動物實驗的基本知識。
材料 1、動物：健康成年家兔，雄性，體重2～3公斤。
2、器材：剪刀、鑷子、注射器（2ml、50ml）附針頭（9號、6號）、稱量瓶（10ml）、量筒、動物固定架、滅菌三角燒瓶（200ml）、手術(shù)器械一套、血管夾、黑絲線、塑料放血管等。
3、試劑：滅菌生理鹽水；純化人IgG（10mg／ml）；消毒酒精及碘酒；羊毛脂；石蠟油；活卡價苗（BCG）（75mg／ml）； 弗氏不*佐劑（FIA）制備：稱羊毛脂10克，逐滴加入石蠟油40ml，邊滴邊研磨，分裝于疫苗瓶中（每瓶10ml），高壓滅菌（8磅20分鐘）后保存?zhèn)溆??！「ナ?佐劑乳化抗原（FCA-IgG）的制備：將FIA予溫（60℃30分鐘），吸取3ml于研缽中，逐滴加入活BCG（75mg／ml）0.5ml及純化人IgG2.5ml（2.4mg／ml）牨_滴入邊研磨直至形成均一性的乳狀液，取1滴滴于冷水面上不散開為合格。
方 法:
一、免疫方法：根據(jù)抗原的性質(zhì)不同而異。下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說明。
（1）用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮膚；
（2）*次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏*佐劑（FCA）乳化的抗原（人IgG）下稱FCA-IgG）液1ml，每側(cè)腳掌皮下各注入0.5ml。
（3）第二次免疫：間隔10-14天后，于兩側(cè) 窩及鼠蹊部腫大的淋巴結(jié)內(nèi)注入FCA-IgG，每個淋巴結(jié)注0.1ml，其余注入淋巴結(jié)附近皮下共1ml。如淋巴結(jié)未腫大或腫大不明顯時，直接注入兩側(cè) 窩及鼠蹊部皮下。
（4）間隔7-10天后，從耳靜脈采血0.5～1.0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體效價（即試血）。效價至少應(yīng)達(dá)到1∶16以上時才能放血。
（5）若效價未達(dá)到要求，可用不加佐劑的抗原液（人IgG）耳靜脈內(nèi)注射免疫。即于1周內(nèi)注射3次，分別為0.1、0.3、0.5ml。間隔1周再試血。如效價達(dá)到要求應(yīng)立即放血。另外,也可在第2次免疫后，以弗氏不*佐劑（FIA）乳化的抗原（人IgG）（簡稱FIA-IgG）再免疫1-2次。注射部位、劑量和間隔均同第2次，再試血測抗體效價，如效價達(dá)到要求立即放血。
二、放血：
（一） 心臟采用血法
（1）家兔仰面，四肢縛于動物固定架上（或由助手抓住四肢固定）；
（2）剪去左胸部兔毛，消毒皮膚；
（3）用左姆指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟，并使心臟固定于左胸側(cè)位置。然后，以左拇指觸摸心臟搏動zui強的部位；
（4）用50ml注射器（連接16號針頭），傾針45°角度，對準(zhǔn)心搏zui強處刺入心臟抽血致死；
（5） 將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中，待凝固后分離血清。
（二） 頸動脈放血法
（1）家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚；
（2）沿頸部中線切開皮膚約10cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突?。?/font>
（3） 分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動脈后使之游離；
（4）于動脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動脈用血管夾夾住；
（5）用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口，插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫；
（6）松開血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80～100ml。
三、分離血清：將三角燒瓶的血置37℃溫箱1小時，再置4℃冰箱內(nèi)3～4小時。待血液凝固血塊收縮后，用毛細(xì)滴管吸取血清。于3000rpm離心15分鐘，取上清加入防腐劑（0.01％硫柳汞或0.02％疊氮鈉，zui終濃度），分裝后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/font>
結(jié)果鑒定：
以雙相瓊脂擴散試驗測定所獲免疫血清的抗體效價，并用瓊指免疫電泳鑒定免疫血清中抗體的質(zhì)量，應(yīng)產(chǎn)生單一的沉淀弧線。鑒定方法的具體步驟參見有關(guān)部分。
注意事項：
1. 免疫用實驗動物的抗體反應(yīng)性個體差異性較大，因此免疫時至少應(yīng)選用兩只以上動物。另外，不能使用妊娠動物。
2. 免疫用的抗原必須經(jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射，否則將明顯影響抗原的免疫效果。上述制備乳化抗原的方法較費時、費力。采用H-81微型振蕩混合器法或三腔管研磨法制備。前者是將抗原液與佐劑按比例混合后，置于混合器上使之劇烈振蕩（頻率2900轉(zhuǎn)／分，振幅6mm）；后者是將免疫用的佐劑和抗原液按比例混合后，吸入注射器內(nèi)再將注射器連接于三腔管上反復(fù)抽吸研磨。這兩種方法約1小時即可使抗原充分乳化。
3. 佐劑一方面可提高特異性免疫反應(yīng)的效果獲得價的免疫血清，但若抗原不純時，可使抗原中極微量的污染物（0.005mgN）產(chǎn)生抗體，以致導(dǎo)致免疫血清的純度受到影響。另外，有些實驗動物種系對BCG過敏，尤其是豚鼠其次是家兔，當(dāng)再次注射*佐劑時,可以引起變態(tài)反應(yīng)而導(dǎo)致免疫失敗。為此，第二次免疫注射時應(yīng)減少佐劑中BCG的含量或改用不*佐劑，以減少和防止變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。
4. 抗原的劑量決定于抗原的種類。對免疫原性強的抗原劑量應(yīng)相別較少，免疫原性弱的抗原劑量可相對較多。抗原的用量一般以體重計算。在使用佐劑的情況下，一次注入的總劑量以0.5mg／kg體重為宜。如不加佐劑時劑量可加大10倍。另外，免疫周期長者可少量多次注射，免疫周期短者可較大量少次注射。
5. 免疫方法上也可采用多點注射法免疫動物。即于家兔脊柱兩旁選4-6點皮下注射，同時于兩側(cè)肩部（或臂部）和鼠蹊部各注一處。每點注0.2ml，間隔2周后再于上述部位選不同點同上注射，也可產(chǎn)生價的免疫血清。
