一、單相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)
原理
一種定量試驗(yàn)，將一定量的抗體混合于瓊脂內(nèi)，傾注于玻片上，凝固后，在瓊脂層上打孔，再將抗原加入孔中，使其向四周擴(kuò)散?？乖贵w復(fù)合物形成的沉淀環(huán)直徑與抗原的濃度成正比。如事先用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，則未知標(biāo)本中的抗原含量即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出。本試驗(yàn)主要用于檢查標(biāo)本中各種免疫球蛋白和血清IgG含量。
材料
１．抗體：羊抗人IgG單價(jià)抗血清。
２．抗原：待檢血清。
３．３％生理鹽水瓊脂、生理鹽水、載玻片、直徑３mm打孔器、小三角燒瓶、毛細(xì)滴管、濕盒。
方法
1、制備含抗體的瓊脂板
取羊抗人IgG單價(jià)抗血清一瓶（效價(jià)1：80），量取0.3ml于一小三角燒瓶中，加生理鹽水11.7ml（40倍稀釋混勻，置56℃水浴中恒溫2~3分鐘）。
取3%生理鹽水瓊脂一管，隔水加熱使溶，然后置56℃水浴中，待瓊脂溫度降至56℃時(shí)，立即加入等量1：40稀釋抗血清，迅速輕輕混勻，勿使產(chǎn)生氣泡，迅速傾入載玻片上，每片3.5ml，待凝固后打孔。如下圖所示。
2、稀釋待檢血清
將待檢血清用生理鹽水作40倍稀釋?zhuān)?/font>
3、打孔、加樣
每份檢樣加兩孔，加滿（但不要溢出），加樣時(shí)毛細(xì)滴管不要?jiǎng)澠骗傊?/font>
4、溫育
將瓊脂板置搪瓷盒，墊濕紗布或海綿以防干燥，37℃恒溫箱24h。
結(jié)果觀察與分析
測(cè)量并求出每份檢樣兩孔的沉淀環(huán)平均直徑，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出IgG含量。
標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度（mg/100ml）
標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
二、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)
原理
常用于定性檢測(cè)，也可用于半定量檢測(cè)。將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠板上相鄰近的小孔內(nèi)，讓它們相互向?qū)Ψ綌U(kuò)散。當(dāng)兩者在zui適當(dāng)比例處相遇時(shí)，即形成一條清晰的沉淀線。根據(jù)有否出現(xiàn)沉淀線，可用已知的抗體鑒定未知的抗原，或用已知的抗原鑒定未知的抗體。臨床常用本方法檢查原發(fā)性肝癌患者血清中的甲胎蛋白，作為原發(fā)性肝癌的早期輔助診斷。
甲種胎兒蛋白（α-Fetal protein, AFP），是胎兒組織及體液中的正常組織成份。胎兒在第9周才出現(xiàn)此種蛋白，13~19周達(dá)高峰，到21周后逐漸下降，胎兒出生后該蛋白即行消失或含量甚微，普通試驗(yàn)方法檢查不出，而肝癌病人及個(gè)別卵巢癌或睪丸癌病人的血清檢出有此種蛋白。
材料
1．抗AFP血清、已知肝癌病人AFP陽(yáng)性血清、待檢病人血清。
2．1.2%瓊脂（用生理鹽水配成）。
3．載玻片、毛細(xì)吸管、濕盒。
方法
1．制備瓊脂玻片 將已知加熱溶化的1.2%瓊脂3.5ml，迅速傾入載玻片上。
2．打孔 待凝固后用打孔器按下圖樣打孔。（孔徑3mm，孔距4mm）
2、3、5孔待檢血清為AFP陽(yáng)性
3．加樣
以上方孔為第1孔，按順時(shí)針?lè)较蚍謩e稱(chēng)為2、3、4、5和6孔，中央孔為7孔。7孔加入抗AFP血清，1、4孔加入已知AFP陽(yáng)性血清（或AFP），作為陽(yáng)性對(duì)照孔；6孔加入已知AFP陰性血清，作為陰性對(duì)照孔，其余2、3、5孔為試驗(yàn)孔，加入待檢血清。
4．溫育 置濕盒室溫或37℃溫育12-24 h。
結(jié)果觀察
1、4孔與7孔間應(yīng)出現(xiàn)白色沉淀線（如上左圖1與7，4與7），6與7孔間應(yīng)不出現(xiàn)白色沉淀線。若2、3、5孔與7孔間出現(xiàn)白色沉淀線而且與陽(yáng)性對(duì)照沉淀線吻合者如圖中2、3、5與1、4孔間，即為實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，表明待檢血清中含有AFP（即AFP陽(yáng)性）。如出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照相連接，且呈槍刺狀如上右圖中4與5孔間，說(shuō)明二者間有共同抗原成分；如出現(xiàn)成交叉的沉淀線如上右圖3與4，則是非特異性沉淀反應(yīng)，為假陽(yáng)性反應(yīng)，乃判為實(shí)驗(yàn)陰性，表明待檢血清為AFP陰性。
三、 對(duì)流免疫電泳
原理 在一定條件下，膠體顆粒是帶有電荷的，這些帶電膠體顆粒在電的影響下發(fā)生移動(dòng)。如膠體顆粒帶負(fù)電，則移向陽(yáng)極；反之，移向陰極。這種現(xiàn)象稱(chēng)為電泳。
對(duì)流免疫電泳是將病人血清（待檢抗原）放在瓊脂板陰孔內(nèi)，已知抗血清（含有已知抗體）放于陽(yáng)孔內(nèi)，在堿性環(huán)境條件下同時(shí)進(jìn)行電泳，抗原由陰極向陽(yáng)極移動(dòng)快，而抗體系丙種球蛋白，等電點(diǎn)在pH6~7之間，故帶負(fù)電荷少，移動(dòng)速度慢，由于電滲作用結(jié)果向陰極倒退，于是抗原抗體在電場(chǎng)中相遇，當(dāng)兩者比例適當(dāng)時(shí)，則特異性抗原抗體互相結(jié)合，便形成肉眼可見(jiàn)的白色沉淀線。
材料
1．1%，PH8.6，0.075M巴比妥緩沖液。
2．抗AFP血清，已知AFP陽(yáng)性血清，待檢病人血清。
3．玻片、吸管、打孔器、毛細(xì)滴管、電泳儀等。
方法
1．將用緩沖液配制好的1.2%瓊脂隔水加熱溶化，趁熱吸取3.5ml加于玻片上，冷凝后打孔，孔直徑3毫米，二孔間距離3毫米。
2．分別從上至下向左列1、3、5孔內(nèi)加入抗AFP血清；向右列2孔內(nèi)加待檢病人血清，4孔內(nèi)加已知AFP陽(yáng)性血清作為陽(yáng)性對(duì)照，6孔內(nèi)加已知陰性對(duì)照血清。各孔加滿為度，勿使外溢，
3．將瓊脂板置于電泳槽內(nèi)，抗原端入陰極側(cè)，抗體放陽(yáng)極側(cè)，二端貼上浸透電泳緩沖液的4層紗布條。
4．通電，固定電壓5-6伏/厘米長(zhǎng)，通電45~60分鐘左右。
結(jié)果觀察
電泳畢，關(guān)閉電源，取出瓊脂板。在黑色背景上方，透過(guò)散射光線，首先觀察3與4孔間（陽(yáng)性對(duì)照組）、5與6孔間（陰性對(duì)照組）的白色沉淀線是否出現(xiàn)；再看試驗(yàn)孔，如孔間未出現(xiàn)這樣的沉淀線，則該待檢血清為AFP陰性血清。
四、火箭免疫電泳
原理： 火箭免疫電泳是將電泳與單向擴(kuò)散結(jié)合的一種免疫技術(shù)。將抗體溶入瓊脂后制板，在瓊脂板的一側(cè)打孔，加入待檢樣品及不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原。電泳時(shí)抗原在含定量抗體的瓊脂中向正極移動(dòng)，并形成濃度梯度，在適宜的部位形成火箭狀的沉淀峰。沉淀峰的高度與抗原的含量成正比，故可定量測(cè)定抗原。
方法：
1、制備瓊脂板
將抗體血清按一定比例與溶化好的1.5%瓊脂在56℃水浴中混勻，迅速澆注成2毫米厚的瓊脂板。
2、打孔
3、加樣：分別加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液和待測(cè)抗原，每孔10微升。
4、電泳：將瓊脂板放入電泳槽，抗原放陰極側(cè)，抗體放陽(yáng)極側(cè)，兩端貼上浸透電泳緩沖液的4層紗布條。固定電壓5~6伏/厘米長(zhǎng)，通電時(shí)間為45~60分鐘左右，觀察結(jié)果。
第四節(jié) 溶血反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)
除凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)外，常用的抗原抗體反應(yīng)還有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、溶血空斑試驗(yàn)等。本實(shí)驗(yàn)介紹補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理
了解補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)方法及結(jié)果分析。
補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是一種有補(bǔ)體參與，并以綿羊紅細(xì)胞及溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗
體反應(yīng)。如被檢血中有相應(yīng)抗體存在，則加入相應(yīng)抗原與補(bǔ)體后。由于抗原抗體形成復(fù)合物，可使補(bǔ)體與之結(jié)合，溶液中即無(wú)游離補(bǔ)體存在。但由于這種結(jié)合肉眼不能區(qū)別，故需加入指示系統(tǒng)（綿羊紅細(xì)胞及其溶血素）。如補(bǔ)體已為試驗(yàn)系統(tǒng)抗原抗體復(fù)合物所固定，加入指示系統(tǒng)后，因無(wú)補(bǔ)體與之結(jié)合，則不發(fā)生溶血（溶血與否、肉眼易于區(qū)別），是為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽(yáng)性，表明抗原與抗體相對(duì)應(yīng)。如出現(xiàn)溶血。為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陰性。表明試驗(yàn)系統(tǒng)中抗原與抗體不相應(yīng)。補(bǔ)體末被固定，加入指示系統(tǒng)后。補(bǔ)體與之結(jié)合。從而發(fā)生溶血反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)材料
1、抗原:甲型（或乙型）副傷寒桿菌菌液、2%綿羊紅細(xì)胞懸液。
2、抗體:甲型（或乙型）副傷寒桿菌診斷血清。溶血素（2個(gè)單位/0.25ml）。
3、補(bǔ)體:琢鼠血清（2個(gè)實(shí)用單位/0.25ml）
4、其它:生理鹽水、小試管、吸管等。
實(shí)驗(yàn)方法：
1、取5只小試管、排于試管架上并注明管號(hào)。
2、第1管加生理鹽水0.4m1，再用吸管取已滅活（56℃加溫30分鐘）的抗體血清、lml（或被檢血清）加入*管，吸吹三次使之充分混勻，然后吸出0。25ml放入第2管，兩管中的血清均為1:5稀釋。
3、按下表所示順序進(jìn)行操作。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
先觀察有無(wú)溶血現(xiàn)象，各對(duì)照管結(jié)果是否正確。
溶血現(xiàn)象:紅細(xì)胞溶解，混濁液變?yōu)榧t色透明液體;不溶血現(xiàn)象:紅細(xì)胞未溶解、混濁液不變。
第2、3、4管因缺乏相應(yīng)待檢抗原抗體復(fù)合物，故應(yīng)*溶血，第5管因僅有羊紅細(xì)胞和生理鹽水故不應(yīng)溶血。以上均為對(duì)照管。
第1管不溶血者為補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)陽(yáng)性。
實(shí)驗(yàn)五 50%溶血試驗(yàn)（CH50）測(cè)定補(bǔ)體
50%溶血試驗(yàn)即求得能使50%致敏羊紅細(xì)胞發(fā)生溶血的zui小量血清，然后計(jì)算出每毫升血清中補(bǔ)體含量。
圖12由溶血素致敏洋紅細(xì)胞的溶血程度與腸鼠血清（補(bǔ)體）量增加之間的關(guān)系
以補(bǔ)體量作為橫坐標(biāo)，溶血百分?jǐn)?shù)作為縱坐標(biāo)，可得到一個(gè)清晰的“S”形曲線。在50%溶血周?chē)?，線段近似一條直線。因此當(dāng)補(bǔ)體用量稍有變動(dòng)，就可對(duì)溶血程度發(fā)生很大影響。所以用50%溶血作為終點(diǎn)要比100%溶血更為敏感。
材料及器材
1．巴比妥緩沖液（BB，pH7.4）：使用時(shí)用蒸餾水1：5稀釋
NaCl:85g 巴比妥：5.75 g 巴比妥鈉：3.75 g Mgcl2：1.017g Cacl2：0.166 g 蒸餾水2000ml，過(guò)濾，4℃保存。用時(shí)用此液1份加4份蒸餾水，當(dāng)日配用。
2．2％SRBC懸液：新鮮脫纖維羊血，10倍NS洗3次。前兩次每次2000rpm*5min，zui后一次2500rpm*10min，取羊紅細(xì)胞用BB液配成2％SRBC懸液
3．溶血素（2U）、被檢血清（新鮮豚鼠血清）、水平離心機(jī)、水浴箱、721型分光光度計(jì)、
4、制備50％溶血標(biāo)準(zhǔn)管：取2％SRBC懸液2ml加蒸餾水8ml，SRBC全部溶解，為100％全溶管。取全溶管上清液2.5 ml加BB液2.5 ml，混勻，即為50％溶血標(biāo)準(zhǔn)管。
方法：
1．制備1：20血清 抽取靜脈血于試管中，室溫下靜置，分離血清（2小時(shí)內(nèi)），用BB液稀釋為1：20。
２．制備50％溶血標(biāo)準(zhǔn)管
３．補(bǔ)體CH50單位測(cè)定：取試管10支，分別編號(hào)1、2、3。。。。。10，按下表加樣
⑴按下表加樣：
結(jié)果判斷：
取各管先與50％溶血標(biāo)準(zhǔn)管初步目視比較，選擇與標(biāo)準(zhǔn)管相接近的兩管，用721分光光度計(jì)在波長(zhǎng)542nm讀T值，求出兩者中更加接近標(biāo)準(zhǔn)管透光率的一管，根據(jù)此管中加入稀釋血清的量，按下式求出總補(bǔ)體值。計(jì)算每ml血清中補(bǔ)體活性（U/ml）：
注意事項(xiàng)：
1、 待測(cè)標(biāo)本應(yīng)無(wú)溶血、無(wú)污染、無(wú)乳糜血。實(shí)驗(yàn)器材應(yīng)清潔。
2、 緩沖液、致敏羊紅細(xì)胞均應(yīng)新鮮配置。
3、 受檢血清必須新鮮，如放置2小時(shí)以上，會(huì)使補(bǔ)體活性下降。
4、 補(bǔ)體的溶血活性受多種因素的影響，例羊紅細(xì)胞濃度及溶血素的量等。
臨床意義：本法測(cè)定補(bǔ)體的正常參考值：50～100 U/ml。在急性炎癥、感染、組織損傷（如風(fēng)濕熱急性期、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周?chē)?、皮肌炎、傷寒和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎）、腫瘤、骨髓瘤等時(shí)，常可見(jiàn)補(bǔ)體含量升高，使CH50偏高；低補(bǔ)體血癥多見(jiàn)于與免疫有關(guān)的疾病，系病程中消耗了補(bǔ)體所致，如：急性腎小球腎炎、膜增殖性腎小球腎炎、
