放射性碘標記

在RIA中，標記抗原質量的優(yōu)劣，直接影響測定結果，必須制備比放射性強、純度高的標記抗原，并保持免疫活性不受喪失。

　　一、同位素的選擇

　　同位素有穩(wěn)定性和放射性兩種。放射性同位素可利用其衰變時放出的放射線進行測量，這種測量較靈敏而方便，故多用放射性同位素。標記抗原，常用的放射性同位素有³H、¹⁴C、¹³¹I和¹²⁵I等。在使用上各有其優(yōu)缺點，可根據(jù)所進行的放射免疫分析的類型特點，標記物制備和供應情況以及實驗室設備條件等作適當?shù)倪x擇（表8-1）。大多數(shù)抗原分子中都含有C、H等原子，所以用¹⁴C或³H標記不改變抗原的結構及其免疫學活性，且¹⁴C、³H半衰期長，所標記的抗原長時間放置后仍可使用，這都是其優(yōu)點。¹⁴C或³H標記的不足之處是操作較繁瑣，并難以獲得高比放射性的標記物；³H及¹⁴C放出的都是弱β射線，需用較昂貴的液體閃爍計數(shù)器方能獲得較率的測量，且測定操作也較麻煩。但某些抗原用放射性碘標記容易喪失免疫化學或生物學活性者，則仍以采用³H或¹⁴C標記物為佳。

表8-1 標記抗原常用的放射性同位素及其性質

　　大多數(shù)抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改變了抗原的分子結構，往往容易損傷抗原的免疫化學活性；且放射性碘的半衰期較短，標記物放置后因衰變使放射性降低，因而需要經常制備標記物或要求能定期提供放射性碘標記都能適用，放射性碘放出γ—射線，用一般晶體閃爍計數(shù)器就能獲得較率而的測量，測量操作也很簡單。由于這些突出的優(yōu)點，目前在放射免疫分析中，使用物zui多。

　　從應用角度來看，¹³¹I和¹²⁵I又各有其優(yōu)缺點，可根據(jù)實驗的要求、儀器的條件和放射性碘制劑的規(guī)格等條件合理選用。但相對而言，¹²⁵I有較多的優(yōu)點，一是半衰期適中，允許標記化合物的商品化及貯存應用一段時間；二是它只發(fā)射28keV能量的X射線和35keV能量的γ射線，而無β粒子，因而輻射自分解少，標記化合物有足夠的穩(wěn)定性。放射性碘適用于放射免疫分析許多對象（包括蛋白質、肽類、固醇類、核酸類以及環(huán)型核苷酸衍生物等）的標記，且操作簡單，一般實驗室都不難做到。

　　二、蛋白質與多肽激素的

　　要制備高比度、高純度與免疫化學活性好的標記物，首先要有高純度、良好免疫活性的抗原。用作放射標記加網免疫分析的特異性，所以若用純度不高的抗原作標記，則標記后必須采取適當?shù)牟襟E除去雜質，以獲得高純度的標記物。標記對象的純化應盡量采用溫和的方法，否則在純化操作中已受潛在性損傷的蛋白質（這時表面上活性可能還是良好的），再經標記反應時所受的損傷，活性就會顯著降低，影響以后的放射分析結果。有了好的純抗原，還要采用適當方法加以標記，盡量獲取高比放射性、而又能保持良好的特異免疫化學活性的標記物。這些都是放射免疫分析能取得高特異性和高靈敏度的關鍵問題。

　　多肽激素與蛋白質多用碘標記，zui常用的是¹²⁵I。碘化反應的基本過程如下：通過氧化劑的作用，使碘化物（¹²⁵I^-）氧化成的碘分子（¹²⁵I₂），再與多肽激素、蛋白質分子中的酪氨酸殘基發(fā)生碘化作用。所以不管采用哪一種法，標記的化合物內部必須有碘原子可結合的基團，即結構上要含有酪胺基或組織胺殘基。凡蛋白質、肽類等抗原，在結構上含有上述基團的可直接用放射性碘進行標記。如不含上述基團的，放射性碘無法標記，必須在這些化合物的結構上連接上述基團后才能進行碘標記。

　　因此影響蛋白質、多肽碘化效率的因素，主要決定于蛋白質、多肽分子中酪氨酸殘基的數(shù)量及它們在分子結構中暴露的程度；此外，碘化物的用量、反應條件（pH、溫度、反應時間等）及所用氧化劑的性質等也有影響。

　　常用的標記方法有：

　?。ㄒ唬┞劝稵法

　　氯胺T法標記效率高、重復性好、試劑便宜易得，是目前使用zui多的碘標記方法。

　　1．原理氯氨—T（Chloramine--T）是一種溫和的氧化劑，在水溶液中產生次氯酸，可使碘陰離子氧化成碘分子。這活性碘可取代肽鏈上酪氨酸苯環(huán)上羥基位的一個或兩個氫，使之成為含有放射性碘化酪氨酸的多肽鏈。

　　2．方法以¹²⁵I—AVP的制備為例。

　?。?）碘化反應：AVP5μg+0.5mol/l PB50μl（pH7.5）+¹²⁵1800μCi,混合后，加入新配置的Ch—t 30μg/15μl（0.05mol/l PB, pH7.5）。迅速振蕩混勻，室溫下反應40s。

　?。?）終止碘化反應：加入還原劑偏重亞硫酸鈉40μg/20μl（0.05mol/l PB, pH7.5）,以終止碘化反應。

　?。?）Bio—Gel P₂層析純化：將碘化反應混合液注入Bio—Gel P₂柱，用0.1n HAC溶液洗脫，分部收集，每2min收集一管，共收集60管。

　?。?）放射性測量：測定各收集管的放射性，出現(xiàn)兩個峰，*峰為¹²⁵I—AVP，第二峰為游離碘鹽峰。*個峰中計算zui高的幾管，留下備用。

　　為了解標記抗原的質量，每次碘標記后應計算出碘的利用率，標記上多少放射性碘，以及每微克抗原結合上多少放射性碘。

　?。?）標記抗原的貯存：經純化與檢查后的標記物、加入1/8體積的異丙醇，分成若干小份，置于鉛罐中，在-20℃以下的冰箱中貯存?zhèn)溆茫瑧苊夥磸蛢鋈?。標記抗原在貯存中是不穩(wěn)定的，這是因為：一是脫碘，標記的碘從原來位置上脫落，變成游離碘；二是蛋白損傷、變性，成為聚合大分子或斷鍵成小分子碎片。由于上述原因，使B/F明顯降低，標準曲線斜率變小，以致不能使用，故需分離純化，其方法是用Sephadex G100長柱（40～80cm ）過柱，洗脫后出現(xiàn)3個峰。第1個峰分子量大，是蛋白變性的聚合的大分子，尚保留部分抗原決定簇，免疫活性弱；第2個峰是純抗原的蛋白峰，免疫活性好；第3個峰是游離¹²⁵I或小分子碎片，不具備免疫活性。收集到的第2個純抗原蛋白峰，免疫活性好；第3個峰是游離¹²⁵I或小分子碎片，不具備免疫活性。收集到的第2個純抗原蛋白峰，其性能類似于新鮮標記的抗原。分離純化的方法解決了標記抗原的貯存、長期使用問題，特別對來之不易的抗原更顯得重要。

　　2．注意事項

　?。?）放射性碘源的選用：無載體的¹³¹I或¹²⁵I均可用于碘化標記，但應盡量選用新鮮的、比放射強度高的、含還原劑量少的放射性碘源。碘源的比放射強度≥50～100mCi/ml，至少也要>30mCi/ml，否則加入碘源的容量要增加，隨著帶入碘源中含有的還原劑（為放射性碘源運輸保存所需加入）量也增加，這將會顯著降低碘利用率及標記蛋白比放射強度。放置較久和放射性碘源，一方面因衰變致比放射強度降低，另一方面因水的輻射化學產物增多（主要是¹³¹I源），都會降低標記時的碘利用率。放射性碘源含還原劑（如Na₂S₂O₅等）量多時，會抵消氯胺T的作用，降低碘利用率，甚至導致標記*失敗。放射性碘源要用無載體的，標記所用全部用具和試劑必須不含碘；只要有極少量的碘的污染，非放射性碘就會稀釋放射性碘，使放射性碘利用率顯著降低。為了便于放射性防護和除污染，以及減少射線對蛋白質分子的損傷，標記投入的放射碘量不宜過大，一般以<5mCi為宜。

　　（2）放射性碘與多肽、蛋白質用量的比例：這比例對標記結果的影響很大。如上述原因，一般標記時放射性投入量不宜過多，示蹤實驗室中常規(guī)每次只用1～2mCi，因而放射性碘與多肽、蛋白質用量的比值主要靠標記時投入的多肽、蛋白質用量來控制。當投入的放射碘量一定時，多肽、蛋白質用量多（即I/多肽、蛋白質比值低），能獲得高碘利用率，但所得標記蛋白比放射強度低；相反多肽、蛋白質用量少（即I/多肽、蛋白質比值高），則碘利用率降低，但所得標記多肽、蛋白比放射性隨此比值變化都有較大的變動；而當此比值<1后，則碘利用率再下降的幅率較小，標記多肽、蛋白比放射性也不會再增加多少。

　　（3）氯胺T與偏重亞硫酸鈉的用量及碘化反應時間：氧化碘化標記法中，會導致失活的zui主要原因是氧化還原。氯胺T是氧化劑，早期用氯胺T法作碘化標記時氯胺T用量都比較大，或碘化反應時間較長，結果導致蛋白質結構和活性的嚴重損傷。氯胺T用量大，或長時間進行碘化反應，結果并不能使碘利用率和標記多肽、蛋白質比放射強度提高多少，反而使標記多肽、蛋白活性下降。當用不含還原劑或還原劑很少的放射性碘源時，試以各種蛋白質（包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰島素等）作微量標記，當氯胺T用量為20μg/0.1ml反應液、0～20^。C反應20s，碘利用率都已接近或達到zui大峰，再加大氯胺T用量和延長反應時間是沒有必要的。隨放射性碘源中還原劑增多，氯胺T用量也應增加，以達到預期的碘利用率，但決不應盲目加大氯胺T用量和延長碘化反應時間（通常反應時間不要超過1min），否則會導致標記多肽、蛋白質嚴重失活，不能用于實驗。當然，減少氯胺T用量要在了解放射性碘源還原劑含量的基礎上，否則碘源中還原劑量較多，雙盲目減少氯胺T用量，就會使標記失敗。一般用¹²⁵I標記時，氯胺T用量要適當加大。加入氯胺T后必須迅速混勻，以防標記不均勻。氯胺T與偏重亞硫酸鈉溶液要新配制的。

　　氯胺T用量減少了，Na₂S₂O₅用量也就可以隨之減少。為保證按時終止碘化反應，實驗時加入Na₂S₂O₅一般都是過量的。氯胺T用量大時，加入Na₂S₂O₅的剩余量也就會隨之增加，這就可能加重某些對還原劑敏感的蛋白質或多肽生物活性的損傷。為此，Na₂S₂O₅用量也不應過多。只要藥品沒有變質、試劑是新配的，以重量計算Na₂S₂O₅加入量與氯胺T相同就足以保證終止碘化反應（按反應克分子濃度計算，Na₂S₂O₅/氯胺T重量比約0.4），不要盲目加大用量，并應迅速將標記多肽、蛋白質從反應液中分離出來，以盡量減少多肽、蛋白質活性的損傷。

　　某些蛋白質或多肽對氯胺T較敏感，還可進一步減少氯胺T用量、縮短碘化反應時間、降低反應溫度，以保護蛋白質的活性。這對一些較容易喪失活性蛋白質或多肽的碘標記十分重要。

　?。?）碘化反應體積：系指加入Na₂S₂O₅終止反應前液體的總量。碘化反應體積愈小，局部反應物濃度愈高，所得碘利用率和標記多肽、蛋白比放射強度就愈高。所以，標記應采用比放射標記效果。當反應液量少（<0.2～0.3ml）時，反應體積對碘利用率和標記多肽、蛋白質比放射強度的高低影響較大；當反應液量大（>0.5～1.0ml）時則影響較小。微量氯胺T法放射碘標記時，一般多控制碘化反應體積<100μl。

　?。?）碘化反應溫度：溫度升高，碘化反應速度加快，碘利用率有所增加。但總的來看，反應溫度的影響不很大，一般從0^℃到20℃碘利用率相差不過百分之幾，故一般在室溫下進行標記操作就可能獲得重復性好的結果。有些蛋白質或肽類極易喪失活性，則可在0℃進行碘化反應。

　　（6）碘化反應的pH值：受氧化劑氧化生成的活性碘，對多肽鏈的酪氨酸基苯環(huán)羥基鄰位的碘化作用，zui適pH是7.3～7.8之間。當pH變化時，碘化位置也會發(fā)生變化，例如pH值較高時，組氧酸的咪唑環(huán)也可被碘化；當pH4～5時，活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羥基吲哚，導致肽鏈斷裂。這些都會影響蛋白質或多肽的放射性碘化反應，或引起降解或失活。因此作放射性碘化標記時，除放射性碘源外，所有的試劑都應用適當?shù)木彌_液配制，保證碘化反應在*pH條件下進行。

　?。?）微量蛋白質或多肽的吸附損失：界面的吸附損失，在使用大量蛋白質或多肽類時是可以忽略的，但作微量法標記時投入的蛋白質或多肽類只在微克甚至毫克甚至毫微克水平，界面吸附導致的損失就不能忽略。例如制備¹³¹I—ACTH時，所用ACTH濃度低到50Pg/ml時，因表面吸附可損失10%～30%，甚至高達75%。改變pH、加入非特異性載體蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器時，能減少吸附，但不能*消除。一般殘留在反應管和滴管上的放射性為投入總放射性的2%～8%、殘留在層析柱上折占5%～10%。殘留量隨標記蛋白比放射性強度而直線增減，殘留者幾乎全部都是標記蛋白。由此可見，微量蛋白質或多肽受吸附而損失的量是不容忽略的。由于微量蛋白質、多肽會被顯著吸附而丟失，所以標記時投入蛋白質、多肽量過微（如<2μg）也是不適宜的，否則標記蛋白質、多肽的收回率會太低，并在計算上會造成較大的誤差。

　?。?）不同蛋白質、多肽碘化標記的差別：由于不同的蛋白質和多肽分子中含有的酪氨酸數(shù)目不同，而且其空間結構也不相同，分子中的酪按酸殘基有的容易發(fā)生碘化反應，有的就不容易碘化，因此同樣條件下進行碘化標記，不同蛋白質或多肽對碘的利用率是不相同的。不同蛋白質經碘化標記后生物活性受損的情況也各不相同。例如ACTH、促性腺激素釋放激素（GRH）、促黃體激素釋放激素（LRH）等多肽，碘化標記后容易喪失激素活性或與受體結合的活性；而AFP及人絨毛膜促性腺激素（HCG）等的碘化標記，則較容易保存良好的免疫化學活性。

　　盡管不同多肽、蛋白度的碘化標記結果有所差別，但上述討論的因素對不同多肽、蛋白質碘化標記的影響有共同的規(guī)律。掌握了這些因素，就容易成功地獲得合格的標記物。

　　不同多肽、蛋白質的分子量大小、理化性質各不相同，放射碘化標記反應后，可根據(jù)具體情況采取不同的方法將標記蛋白質（或多肽）與未反應的游離放射性碘及受損傷的標記物分開，常用的方法有凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、各種電泳法等。

　?。ǘ┤檫^氧化物酶法（LPO）

　　本法反應溫和，對抗原、抗體免疫活性影響小，已被廣泛應用。缺點是標記率較低，一般為20～40%。

　　1．原理此法是利用乳過氧化物酶（Lactoperoxidase）有促進微量過氧化氫對¹²⁵I^-的氧化作用，生成¹²⁵I⁺，并標記在多肽、蛋白質酪氨酸分子上。

　　2．方法以標記蛋白質抗原為例。

　　（1）反應液組成：蛋白質2～5μg溶于磷酸緩沖液10～25μl中，加入Na¹²⁵i 1m Ci（10μl）、乳過氧化物酶溶液25ng（10μl）、H₂O₂200ng（10μl）；

　　（2）在室溫保溫7min；

　?。?）加入H₂O₂200ng（10μl）；

　?。?）過7min再加入H₂O₂（3μl）；

　?。?）保溫7min后，加入0.5ml、10mmol/L巰基乙醇以停止反應；

　?。?）10min后加入NaI載體溶液1ml ；

　?。?）按常規(guī)方法分離純化。

　　3．注意事項

　　（1）LPO質量好壞，可直接影響標記率，LPO應在使用前新鮮配制，以防酶活性降低。

　?。?）LPO用量應小于總蛋白質用量的1%，以減少酶自身碘化而帶入的放化雜質。

　?。?）碘化反應速率分析表明，酶的催化速度很快。

　?。?）碘化反應在pH4.0～8.5較寬范圍內均可進行，zui適pH值應依據(jù)蛋白質本身性質而定。

　?。?）H₂O₂應保持低濃度，如高于0.1mmol/L，對酶的活性將有抑制作用。

　?。ㄈ㊣odogen碘化法

　　此法具有標記率高、反應體積?。?ml水平）、可用低濃度的¹²⁵I原料、對多肽激素和蛋白質的免疫活性損失小、穩(wěn)定等優(yōu)點，系常規(guī)的碘化方法之一。

　　1．原理　用Iodogen為氧化劑，對蛋白質和多肽抗原進行碘化標記，把¹²⁵I直接引進分子中的酪氨酸殘基上。標記過程中被標記樣品不與Iodogen混合，標記后取出樣品即停止反應，不使用任何還原劑。

　　2．方法

　?。?）標記之前，先把Iodogen溶于有機溶劑，涂于管底，并使之干燥。

　　（2）標記時，將蛋白質溶液10～20μg/10μl（0.5mol/L,pH7.5PB）置于反應管中，反應管置于冰浴中。碘化時，¹²⁵I與蛋白質克分子之比例為1～1.2。反應時間在溫和的連續(xù)的攪拌下可達10min，從反應管中轉移出反應混合液，使其反應停止。反應液轉移到含有200μl0.01mol/L、pH7.2PB和0.15mol/L NaCl溶液中，層析分離前再放置5min，使其未標記的碘離子還原成分子碘，以避免在帶有緩沖液的柱中使白蛋白碘化。

　　3．注意事項

　?。?）涂有Iodogen的反應管，有氮氣中密封，并貯存在-20^℃條件下，至少可用3個月。打開管，使用時間很短。

　?。?）碘化反應時間，7min時標記率達zui高，10min時略有減少。PH6.0～8.5時，標記率zui高。

　?。?）Iodogen與蛋白質的比率是標記率的函數(shù)。zui大的標記率是1克分子的Iodogen與8克分子或再多量之比。

　　（四）?；噭˙olton和Hunter試劑）法

　　1．原理這個方法用?；瘎?--（4-羥苯基）丙酸—N琥珀酰胺酯（Bolton—Hunter試劑）做連接試劑，將¹²⁵I標記在羥苯基的2，5位置上，再將琥珀酰胺酯水解，通過一個酰氨鍵將3--（4—羥基—5—¹²⁵I—苯基）接在蛋白或多肽的末端氨基上。

　　2．方法¹²⁵I—Bolton—Hunter試劑可用氯胺T法自行制備，出已有該試劑的苯溶液作為商品出售。使用時取一定量的標記酯（μmol 蛋白用3～5μmol標記酯），用氮氣吹除苯，投入欲標記蛋白5～10μg及緩沖液10～50μl,pH8.0～8.5為宜，在冰浴中反應15～30min后，加入多量氨基酸（如甘氨酸），使過量標記酯消耗掉以終止反應。

　　此法避免了蛋白質與氧化劑的接觸，又避免了與放射性碘原子的直接接觸，可防止碘源中有害物質對蛋白質的損傷，適用于標記缺乏酪氨酸的蛋白質或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后會引起蛋白質的失活。其缺點是標記技術比較復雜，需要接觸較多的放射性，經二步反應，碘標記率比較低。一般認為此法不宜標記短肽，而適于分子量大于1萬的蛋白質。

　　三、放射性標記化合物的純化與鑒定

　?。ㄒ唬┘兓瘶擞浕衔锏某Ｓ梅椒?/p>

　　不論使用何種制備方法，要獲得合格的標記化合物，都必須將反應物經過仔細的分離、純化。另外，一些標記化合物，經過一定時間的存放后，往往會出現(xiàn)不純物，而需再純化。如碘標記生長激素（¹²⁵--HGH）,在剛標記的第2天，從Sephadex G-100過濾譜上可見，幾乎所有的碘化HGH都集中在峰II；保存1個月后，峰II組份減少，峰I和峰III成分明顯增加，峰I是集聚的標記生長激素，而峰III是不具有免疫活性的放射性化學雜質（圖8--3）。

圖8－3　¹²⁵I—HGH的Sephadex G-100過濾譜

實線：新鮮制備的 125I—HGH　虛線：保存1個月的125I—HGH

　　標記化合物的純化方法，除制備比活度低而化學量又較多的標記物可用重結晶、蒸餾、萃取等常規(guī)方法外，一般需用微量分離技術，較方便的是層析法、離子交換法、凝膠過濾及液相層析法等?，F(xiàn)以碘標記蛋白為例，說明以上各種方法的適用情況。

　　1．凝膠過濾法常用的是Sephadex G系列，也有Biogel—P系列。分離標記蛋白與無機碘時，通常用Sephadex G—25或G—50，然后用G—100進一步純化。

　　2．離子交換法一般是制成離子交換層析柱，用于分離純化短肽標記物。

　　3．透析法　能將標記蛋白與小分子化合物很好地分離。

　　4．電泳法可用來分離單碘化、多碘化及已受損傷的蛋白質。

　　5．親和層析法利用蛋白質與其特異抗體或受體的結合來分離、純化標記蛋白質。此法特異性強，保持生物活性好，但操作較復雜。

　　6．液相層析法此法zui大優(yōu)點是分離效果好、快速，但需特殊設備。

　　7．伴刀豆球蛋白A（ConA）吸附法ConA是一種植物凝集素，對糖蛋白有良好吸附能力，因此適于分離標記糖蛋白。吸附的標記糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脫。

　　（二）標記化合物的主要質量指標

　　作為示蹤劑及分析試劑的標記化合物，應具有比一般非標記化合物更高的質量要求。標記化合物的質量指標包括：放射性核純度、放射化學純度、放射性比活度、生物活性和免疫活性以及標記位置和定量分布情況等。

　　1．放射性核純度及其檢查方法

　?。?）放射性核純芳可用下式表示：

　　放射性核純度（%）=所需放射性核素的活度/樣品的總放射性活度×100

　?。?）放射性核純度的檢查方法：每一種核素都有它的特征，即物理半衰期及射線能量，故可通過半衰期及射線能量的測定來鑒別所需放射性核的純度。

　?、贉y定半衰期法：如短半衰期放射性核素，一般可采用時間跟蹤法，每隔一定時間測量放射性一次，共測3～5個半衰期，以每次測得的放射性計數(shù)為縱座標，時間為橫座標，在半對數(shù)紙上作圖，并通過分析，可求出該放射性核素的純度。

　?、跍y定射線能量法：利用每一放射性核素的特征射線譜來檢查放射性核純度。γ發(fā)射體可用γ能譜儀，如檢測⁵⁷Co和⁵⁸Co的核純度：純β-發(fā)射體可用液閃儀，調節(jié)　道寬及淬火校正后，對如³H、¹⁴C、³²P的核純度進行測量；而β、γ混雜垓素，則用吸收法測量，如^99mrTc中母體雜質^99mMo的含量測量，是通過適當厚度的鉛屏蔽，將^99mTc 發(fā)射的能量為141ke V的γ射線減弱后，測定⁹⁹Mo發(fā)射的能量為739Kev 的γ射線。

　　2．放射化學純度及放化純度鑒定

　?。?）放射化學純度：放射性核素標記化合物都是以一定的化學形態(tài)存在的，所以：

　　放射化學純度（%）特定化學形態(tài)的放射性活度/樣品總放射性活度×100

　　放射化學純度受制備方法及原料的化學純度、產物存放條件等影響，一般放化純度控制在95%以上。

　?。?）放射化學純度的測定方法：原則是的化學分離與靈敏的放射性測量相結合。常用下列方法：

　　①放射層析法，又稱放射色譜法：本法是利用色譜技術使混合物中各組份分離，然后測定各組份的放射性活度。它具有選擇性高、分離效果好、操作簡便等優(yōu)點，在放化純度鑒定中是一種重要的分析方法。zui常用的是放射性紙層析法和放射性薄層層析法。

　?、诜派湫砸合鄬游龇ǎ核鼘Ψ蛛x純化標記化合物及鑒定標記化合物的放化純度都有很大潛力，具有分析速度快、分離效率高、適用范圍廣等特點（幾乎80%的有機化合物均可應用）。關鍵是要選擇合適的固定相和流動相，使產品與雜質分離。在流動相中，被分析物各組份的濃度變化可用紫外或熒光檢測器檢測，而其放射性活度，可同時由放射性探測儀測定。放射性活度測定zui簡單的一種辦法，是將洗脫液分部收集，然后在γ儀或液閃儀上進行測量；另一種較理想的是連續(xù)測量，在洗脫液流通池外包圍一個固體閃爍探頭，進行γ計數(shù)或在流通池前加一個三通混合室，用另一個泵混入閃爍液，測定軟β射線?？梢耘c紫外控測器的掃描圖，同步描繪出放射性的分布圖。

　?、鄯派湫院怂胤聪♂尫ǎ喝∫欢浚╓₁）已測定比活度（S_O）的標記化合物（約0.1～10mg），用>1000倍化學量（W₂）的純載體稀釋，充分混勻后反復純化到比活度恒定不變（Sp），此標記化合物的放化純度值應為：

　　有時該值>100%時，往往是由于所用載體化學純度不夠。因本法操作要求嚴格，一般不作常規(guī)放化純度鑒定用。

　　3．化學純度及化學量的測定標記化合物中的非放射性化學雜質雖一般不會對示蹤結果帶來直接干擾，然而這種雜質的含量越多對標記化合物在使用、存放過程中分解、變性的影響就越大。此外，也已發(fā)現(xiàn)某些標記化合物的化學雜質會給使用帶來直接影響。如用氚標記類固醇作放射免疫分析試劑，其中的化學雜質會影響標記抗原與抗體的結合率，使分析靈敏度降低。因此，對標記化合物的化學雜質含量，同樣必須加以控制。

　　要制得化學純度的標記化合物，是對可能產生的雜質加以防止。這要在冷試驗中解決。因為冷試驗所得產品是非放射性的，其化學純度可用常規(guī)方法，如溶點、沸點測定，NMR、紅外、紫外譜分析等手段加以鑒定，得到合格產品后，再按同樣方法及條件進行標記制備。

　　對于標記化合物的化學含量，則必需在標記反應及一定純化步驟后進行，由于需要高比活度的標記化合物，往往樣品的放射性很強，而化學量極微（如某氘標記化合物，分子量為300，每分子上標記2個氘原子，氘的同位素活度為99.8%，則理論上每25mCi（925MBq）的化學量還不足（130μg）,所以需用微量分析法才能測定其含量。一般而言，各種常規(guī)微量分析技術均可應用。目前大多用紫外分光、熒光光度等進行含量測定。

　　4．放射性比活度及其測定

　?。?）放射性比活度簡稱比活度，過去也稱比放射性。

　　比活度＝放射性活度／單位化學量

　　（2）比活度的理論值計算：每種放射性核素有一個比活度理論值，取決于該核素的半衰期和衰變常數(shù)。若N是1毫克原子（1mA）的總原子數(shù)，衰變常數(shù)λ（單位時間衰變的%），則

　　任何元素每1mA的原子數(shù)都相同，等于阿伏加德羅常數(shù)，即6.023×10²⁰個，故

　　若T1/2min為單位，則上式的活度單位為dpm/mA,進行單位換算后為：

　　根據(jù)上式，可計算出每種放射性核素比活度的理論值（常用放射性核素的比活度理論值見表8-2）。如果標記化合物每分子接上一個放射性核素原子，則以上原論值亦為該標記化合物的比活度（每毫摩爾的活度）理論值。

表8-2 一些常用放射性核素的比活度理論值

　?。ㄒ嗉疵糠肿右唤右粋€該放射性核素原子的標記化合物的經活度理論值）

　?。?）放射性比活度測定方法

　?、僦苯訙y定計算法：將標記產品經分離純化后，配成合適的溶液，測定每毫升的放射性活度（如mCi/ml）及含量（μg/ml）從而計算其比活度。對于高經活度的標記物，化學含量甚低，一般需用光譜法，如紫外分光光度法測定其含量。

　?、趯游鰭呙杳娣e計算法：一般應用紙層析或薄層層析，將反應結果尚未分離的反應液點樣、展層，然后在掃描儀上描繪放射性分布圖，根據(jù)描繪的面積來進行計算，如圖8-4。

圖8-4　放射層析掃描面積計算比活度示意圖

₁為標記物峰面積：

S₂S₃為雜質峰及放射性原料峰面積

　　先計算標記率：

　　放射性比活度的計算：若投入的待標記物重量為W，且100%轉化為標記物，則比活度=A·Y/W，其中A為投入的總放射性。

　　如果層析掃描儀有紫外監(jiān)測器和放射性活度計數(shù)率儀可同步測定掃描，則直接可給出比活度。

　?、圩陨砣〈嬎惴ǎ哼@是間接測定標記物比活度的方法。所測定的標記物，需是分離純化后可用于RIA或RRA標記試劑。

　　方法的原理是：作一條常規(guī)的RIA（或RRA）標準曲線，另作一條不加非標記標準品，只加抗體和不同量標記試劑的自身取代曲線。兩者用同一種抗體，且抗體用量*相同。若反應平衡后測定結合部分的放射性，掏算成所加總放射性（注意：對標準曲線總說總放射性各管相同，對自身取代曲線來說各管不同，需分別換算）的百分數(shù)，即結合率B。由于兩條曲線所用抗體的質和量嚴格相同，標記物與非標記標準品與抗體親和力也相同，故B的大小就*取決于各管中標記物和非標記標準品的總量。亦即若從兩標準曲線上取一點相同的B，則

　?。擞浳?標準品）_標準曲線=（標記物）_{自身取代曲線}

　　故由此便可直接計算標記試劑的化學含量并進一步求得比活度。為求準確度高，可取我點B求出平均比活度。

　　用自身取代法測定標記化合物的比活度，只適用于RIA的標記抗原及受體的標記配基。使用時應注意：①標記物與未標記物對抗體（受體）的親和力應相同；②非特異性結合應較小，且計算時應扣除；③制備標準曲線與自身取代曲線時，操作步驟應相同，特別是B與F分離的條件要一致。

　　5．生物活性、免疫活性測定

　　（10）生物活性、免疫活性測定的重要性：放射性標記化合物作為示蹤劑用于生物體內的示蹤研究，或作為分析試劑用于生物活性物質分析，都要求標記化合物不改變其原有的生物活性和免疫活性。當給化物引入放射性原子，即使“同位素標記”大多需經過原子交換或化學反應及分離純化等物理化學處理，有可能造成光學構型及立體構型的改變而使標記物改變性質。“非同位素標記”，如蛋白質分子中引入碘原子，則更易引起蛋白質失活、變性。故測定放射性標記化合物的生物活性和免疫活性，對保證使用效果十分必要。

　?。?）生物活性和免疫活性測定的要求：需根據(jù)使用要求而定，因為同一標記物其生物活性的變化與免疫活性的變化不一定相關；同一標記激素，其與受體結合能力的改變與抗體結合能力的改變也不一定平行。

　?。?）測定方法：測定標記蛋白質或多肽的生物活性和免疫活性常用的方法有下述幾種：

　　①物理化學方法：可用電泳法、吸附法及凝膠過濾法等物理化學方法來測定標記蛋白質的結構改變情況，如標記后受損全傷的蛋白質在電泳時泳動性減少，碘化受損的多肽激素在血紅蛋白涂碳上的吸附性質也有改變，而蛋白質變性聚合時大分子聚合體將在凝膠過濾時不停留在凝膠柱上。這些測定雖較快速方便，但對標記物的生物活性和免疫活性的嚴格判定來說，還是很不夠的。

　　②特異結合試驗：根據(jù)放射性標記化合物用于放射免疫分析等不同要求，分別與其相應抗體或受體進行特異性結合試驗。以放射免疫分析試劑為例，測定其免疫活性的方法是：先觀察標記物與抗體的結合率，如果結合率高，說明抗原的免疫活性較好。進一步觀察標記抗原與非標記對抗體親合力是否一致，做法之一是用不同稀釋度的抗體，分別與標記抗原及與標記抗原加非標記抗原的混合物進行特異結合，其中混合物抗原總濃度要和單獨使用放射性抗原的濃度相同。如單獨使用標記抗原1.0ng,而混合抗原的總濃度亦為1.0ng，其中標記抗原為0.1ng，非標記抗原為0.9ng，比較兩者的結合率，如果基本相同，說明標記抗原保持其原來的親和力，在標記等操作過程中未受到明顯損傷。如圖8-5中，A線與B線基本平行；如果標記抗原免疫活性已有降低，則如C線所示。

圖8-5　標記蛋白的免疫活性測定

　　A；為標記抗原與血清的滴度曲線B：為非標記抗原（加入少量標記抗原）的滴度曲線；C：與A相同，但標記抗原免疫活性已有降低

　　③生物特性測定：如¹²⁵I—纖維蛋白原，可用凝血酶測定其可凝能力，與非標記物相比，視是否有改變。使用何種生物特性測定，根據(jù)標記物的生物性質而定。另外，上述特異性結合試驗，如果受體作異結合劑，也是檢驗用作RRA或RBA分析試劑的標記物生物活性情況的有效方法。