人腫瘤壞死因子α （TNF-α）ELISA試劑盒使用說明書

                              試劑盒僅供研究使用。

藥品名稱：

通用名：人腫瘤壞死因子α （TNF-α）酶聯(lián)免疫分析試劑盒

使用目的：

  本試劑盒用于測定人血清、血漿、或其它組織液中腫瘤壞死因子α （TNF-α）含量。

實驗原理

    本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人腫瘤壞死因子α （TNF-α）水平。用純化的人

腫瘤壞死因子α （TNF-α）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入

腫瘤壞死因子α，再與HRP 標(biāo)記的羊抗人抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過

*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化

成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人腫瘤壞死因子α呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波

長下測定吸光度（OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人腫瘤壞死因子α （TNF-α）濃度。

試劑盒組成

  1   20 倍濃縮洗滌液           50ml×1 瓶       7    終止液                 6ml×1 瓶

  2   酶標(biāo)試劑                6ml×1 瓶        8    標(biāo)準(zhǔn)品（450ng/L）  0.5ml×1 瓶

  3   酶標(biāo)包被板               12 孔×8 條       9    標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液              2ml ×1 瓶

  4   樣品稀釋液               6ml×1 瓶        10   說明書                 1 份

  5   顯色劑A 液              6ml×1 瓶        11   封板膜                 2 張

  6   顯色劑B 液              6ml×1/瓶        12   密封袋                 1 個

標(biāo)本要求

    1．標(biāo)本采集后盡早進行實驗。

    2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP ）活性。

    3．可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

操作步驟

1.  標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10 孔，在*、第二孔中分別加標(biāo)

    準(zhǔn)品100μl，然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二

    孔中各取100μl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，

    混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 棄掉，再各取50μl 分別加到第五、第六孔

    中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各

    取50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混

    勻后從第七、第八孔中分別取50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)

    品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，

    濃度分別為（300 ng/L，200ng/L      ，100ng/L，50 ng/L，25 ng/L）。

2.  加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣

    品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl （樣

    品zui終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混

    勻。
3.  溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。

4.  配液：將20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍稀釋后備用

5.  洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此

    重復(fù)5 次，拍干。

6.  加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7.  溫育：操作同3。

8.  洗滌：操作同5。

9.  顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

    15分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應(yīng)在加終止

    液后15 分鐘以內(nèi)進行。

計算

    以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD              值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的

OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計算出標(biāo)

準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，

即為樣品的實際濃度。

注意事項

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未

   用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間

   控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4．請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD 值

   大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計

   算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5．嚴格按說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)

6．底物請避光保存。

7．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9．本試劑不同批號組分不得混用。

10.  如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn)。

檢測范圍：

  20ng/L -400 ng/L

規(guī)格：

  96 人份/盒

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6 個月

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