DNA產(chǎn)物純化試劑盒簡介
對于TA克隆、酶切或者直接測序等試驗(yàn)來說，純化PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物是非常必要的。以TA克隆為
例，其成功率跟目的片段的純度高低具有重要關(guān)系。雖然未經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物也可以跟載體連接，
但會(huì)增加篩選陽性克隆的難度，因?yàn)?/span>PCR產(chǎn)物中的dNTP和引物等可能也會(huì)跟載體連接。在進(jìn)行連接
試驗(yàn)時(shí)，這些非特異性的產(chǎn)物會(huì)跟特異性產(chǎn)物相互競爭，從而導(dǎo)致連接效率下降。
DNA片段純化回收原理
在獲得DNA片段后，一般采用吸附材料的方法去除雜質(zhì)和純化DNA片段。目前大多數(shù)生物公司都采用硅基質(zhì)吸附材料，可特異性吸附核酸，有效去除體系中的蛋白、鹽類和有機(jī)物質(zhì)。
DNA片段純化回收的種類
根據(jù)DNA片段在待回收體系中是否為單一條帶，可將DNA片段純化回收分為兩大類：直接純化和切膠純化。Solarbio公司針對這兩種純化方法開發(fā)出DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒，可以滿足不同的試驗(yàn)要求。
直接純化
適用于有單一DNA片段或溶液中所有DNA片段都需要回收。對于一些下游試驗(yàn)如測序、SNP分析等，需要從PCR或酶切產(chǎn)物中去除鹽離子、dNTP、蛋白、引物等雜質(zhì)，因?yàn)檫@些成分會(huì)抑制后續(xù)試驗(yàn)的酶活性。
切膠純化
適用于選擇性回收溶液中多種DNA片段中的一種。對于后續(xù)試驗(yàn)，采用切膠純化是有效的方法。通過瓊脂糖凝膠電泳可以分開特異性條帶和非特異性條帶，在紫外光下快速有效地切下目的片段所在位置的凝膠，然后通過進(jìn)一步的純化就可以得到目的片段。對于要求較高的后續(xù)試驗(yàn)，建議采用切膠純化的方法，這樣得到的片段純度比直接純化要高一些。
DNA片段回收純化的一般流程
一、反應(yīng)液收集
PCR反應(yīng)液
1、如要進(jìn)行后續(xù)TA克隆，請選用能在擴(kuò)增產(chǎn)物末端加A尾的聚合酶，如Taq酶或Hotstart Taq酶。
2、如對擴(kuò)增序列保真度要求高，請選用具高保真擴(kuò)增能力的聚合酶，如Pfu酶。
3、由Pfu酶擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物不帶A尾，如要進(jìn)行基因克隆，可選用加A反應(yīng)液對其添加A尾，從而保證克隆效率。
酶切反應(yīng)液
1、酶切時(shí)所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會(huì)干擾酶切反應(yīng)。
2、雙酶切反應(yīng)條件選擇可從兩種酶的反應(yīng)溫度以及反應(yīng)buffer來決定：從反應(yīng)溫度考慮，應(yīng)按照先高溫后低溫的順序進(jìn)行；從反應(yīng)buffer考慮，應(yīng)按照先低鹽后高鹽的順序進(jìn)行。
二、電泳檢測
PCR或酶切反應(yīng)結(jié)束，一般通過凝膠電泳檢測擴(kuò)增或酶切結(jié)果。凝膠電泳分為瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種，其中聚丙烯酰胺凝膠電泳普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸，瓊脂糖凝膠在分離同工酶及其亞型、大分子核酸等應(yīng)用較廣。這兩種疑膠電泳是分離、鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。
瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速、常用約分離純化和鑒定核酸的方法。根據(jù)瓊脂糖的溶解溫度，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖。低熔點(diǎn)瓊脂糖的熔點(diǎn)為62-65℃，溶解后在37℃下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時(shí)，主要用于DNA片段的回收、質(zhì)粒與外源性DNA的快速連接等。
DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速率與瓊脂糖濃度、DNA分子量及構(gòu)象、電泳緩沖液、電場強(qiáng)度等因素有關(guān)。一般來說，DNA片段越大或瓊脂糖濃度越大，其遷移速率越??；而電場強(qiáng)度越高，其遷移速率越大。
分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的電泳緩沖液主要有三種：TAE、TBE和TPE。TBE與TPE緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE會(huì)導(dǎo)致DNA片段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀。TAE緩沖容量低，但價(jià)格較便宜，TBE緩沖液含有的EDTA可螯合二價(jià)陽離子，可抑制DNase活性，防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物降解。
聚丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體在催化劑TEMED和過硫酸銨的作用下聚合形成長鏈，并在交聯(lián)劑N,N’-亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠。
聚丙烯酰胺凝膠電泳特別適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于1kb的DNA片段和DNA序列分析，長度僅相差0.2％（即500bp相差1bp）的核苷酸分子即能分離。
聚丙烯酰胺分辨率較瓊脂糖凝膠分辨率高，按性質(zhì)可分為變性與非變性兩種。前者主要用于單鏈DNA的分離及純化，后者則主要用于雙鏈DNA的分離及純化。
核酸電泳指示劑
核酸電泳常用的指示劑有溴酚蘭及二甲苯青兩種。溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，在0.6％、1％、1.4％和2％瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與1kb、0.6kb、0.2kb和0.15kb的雙鏈線性DNA片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈蘭色，它在1％和1.4％瓊脂糖中電泳時(shí)，其遷移速率分別與2kb和1.6kb的雙鏈線性DNA大致相似。指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液。載樣緩沖液的作用有：①增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。②在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。
核酸電泳染色劑
核酸電泳后，需經(jīng)染色才能顯現(xiàn)出帶型，常用的是溴化乙錠染色法，其次是銀染法。1、溴化乙錠染色法：EB是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。2、銀染法：銀染色液中的銀離子（Ag+）可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物。然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒?？砂押怂犭娪編境珊诤稚?。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色。其靈敏度比EB高200倍，但銀染后，DNA不宜回收。
三、DNA片段純化
根據(jù)電泳結(jié)果，確定待回收的DNA片段在回收體系中是否為單一條帶后，可分別選擇不同的DNA片段純化試劑盒。如果目的DNA片段在回收體系中為特異的單一條帶，則可以選擇DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒；如果在回收體系中除口的DNA片段外還有其它非特異性DNA片段，則需要選擇瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒。
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