活性氧檢測(cè)試劑盒
一．產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
活性氧檢測(cè)試劑盒（Reactive oxygen species assay kit）是一種利用熒光探針 DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測(cè)的試劑盒。DCFH-
DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而 DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使
探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測(cè)DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧
的水平。
本試劑盒提供了活性氧陽性對(duì)照試劑Rosup以便于活性氧的檢測(cè)。Rosup是一種混合物（compound mixture），濃度為50mg/ml。
本試劑盒本底低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便。
本試劑盒可以測(cè)定100－500個(gè)樣品。
二．包裝清單：
DCFH-DA 10mM 0.1 ml
活性氧陽性對(duì)照（Rosup, 50mg/ml） 1 ml
說明書 1 份
三．保存條件：-20℃保存，一年有效。
四．注意事項(xiàng)：
探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會(huì)導(dǎo)致背景較高。
探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長(zhǎng)的掃描和發(fā)射波長(zhǎng)的掃描，以確認(rèn)探針的裝載情況是否良好。
盡量縮短探針裝載后到測(cè)定所用的時(shí)間（刺激時(shí)間除外），以減少各種可能的誤差。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
五．使用說明：
1. 裝載探針
對(duì)于刺激時(shí)間較短（通常為2小時(shí)以內(nèi)）的細(xì)胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對(duì)照及自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞刺激
時(shí)間較長(zhǎng)（通常為6小時(shí)以上）的細(xì)胞，先用活性氧陽性對(duì)照及自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。
原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。去除細(xì)
胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對(duì)于六孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的DCFH-
DA的體積為1毫升。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。
通?；钚匝蹶栃詫?duì)照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
收集細(xì)胞后裝載探針：按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的
DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為一百萬至二千萬/毫升，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分
接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對(duì)照及自己感興趣的藥物刺
激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通?；钚匝蹶栃詫?duì)照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
2. 檢測(cè)
對(duì)于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
對(duì)于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。
3. 參數(shù)設(shè)置
使用488nm激發(fā)波長(zhǎng)，525nm發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用
FITC的參數(shù)設(shè)置檢測(cè)DCF。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。
4. 其它說明
陽性對(duì)照可以按照1:1000的比例使用。例如裝載好探針的細(xì)胞共1毫升，可以加入1微升的陽性對(duì)照刺激。通常刺激后20-30分鐘
內(nèi)可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對(duì)于不同的細(xì)胞，活性氧陽性對(duì)照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30分鐘內(nèi)
觀察不到活性氧的升高，可以適當(dāng)提高活性氧陽性對(duì)照的濃度。如果活性氧升高得過快，可以適當(dāng)降低活性氧陽性對(duì)照的濃度。
另外，對(duì)于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對(duì)照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可以按照1:2000-1:5000稀釋DCFH-DA，使裝載探針時(shí)
DCFH-DA的濃度為2-5微摩爾/升。探針裝載的時(shí)間也可以根據(jù)情況在15-60分鐘內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。
六．使用本產(chǎn)品的文獻(xiàn)：
1. Jia SJ, Jiang DJ, Hu CP, Zhang XH, Deng HW, Li YJ.
Lysophosphatidylcholine-induced elevation of asymmetric dimethylarginine level by the NADPH oxidase pathway in endothelial cells.
Vascul Pharmacol. 2005 Nov 22; [Epub ahead of print] （Impact factor:2.547）
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