邁瑞動物醫(yī)療免疫分析儀

免疫檢測是利用抗原和抗體之間的特異性親和反應來檢測和分析免疫蛋白、受體等生物分子的一種高靈敏度、高選擇性的方法。免疫學檢測技術(shù)能夠用于免疫疾病的診斷、療效評價及發(fā)病機制的研究，如對傳染病、免疫增殖性疾病、免疫缺損病、超敏反應、自身免疫病、腫瘤標志物等的免疫學檢測，具有廣泛的用途。

免疫反應

抗原和抗體結(jié)合發(fā)生的免疫反應具有親和性和特異性，該反應不是化學反應，而是非共價鍵的相互作用，主要包括疏水力、靜電引力、范德瓦耳斯力和氫鍵作用力，這些力的相互作用發(fā)生在側(cè)鏈或多肽鏈主干之間。

疏水力：抗原和抗體分子側(cè)鏈上的某些氨基酸是疏水性膠體，在水溶液中不會與水分子形成氫鍵，當抗原決定簇靠近抗體活性結(jié)合位點時，疏水性氨基酸可排斥水分子形成疏水力，促進二者之間的結(jié)合。

靜電引力：抗原決定簇和抗體分子結(jié)構(gòu)中都含有氨基端（帶正電荷）和羧基端（帶負電荷)，帶有相反電荷的基團之間的靜電引力作用促使抗原和抗體相互結(jié)合。

范德瓦耳斯力：分子與分子之間的作用力，其作用效果主要取決于分子的空間構(gòu)型。

氫健作用力：指在具有親水基團（如羥基、氨基、羧基）的抗體與相對應的抗原相互接近時形成相對微弱和可逆的氫鍵橋梁，促進抗原和抗體的結(jié)合，該作用力比范德瓦耳斯力的結(jié)合力強且更具有特異性。

抗原和抗體的結(jié)合遵循可逆生物大分子相互作用的熱動力學基本原理，平衡方程為：

式中，K為平衡常數(shù)，是反映抗原與抗體結(jié)合能力的指數(shù)，又常稱為親和常數(shù)，范圍為10^6~10^12L/mol；k1為正反應速率常數(shù)：k2為負反應速率常數(shù)；[Ab-Ag]為抗體-抗原結(jié)合物的摩爾濃度；[Ab]和[Ag]分別為游離抗體或抗原的結(jié)合位點的摩爾濃度。

當抗原和抗體之間的親和力較強時，形成的抗原抗體結(jié)合物的結(jié)合牢固，不易解離；反之，結(jié)合物較易解離。雖然抗體和抗原間的免疫反應是可逆的，但是在無外界因素的作用下，抗原-抗體結(jié)合物的自發(fā)解離通常非常緩慢，在含有表面活性劑的高濃度無機鹽溶液中可以加速這一解離過程。二

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 免疫分析是利用抗原與抗體之間高特異性的反應（即免疫反應）實現(xiàn)對抗體、抗原或相關(guān)物質(zhì)進行檢測的方法。免疫分析方法分為競爭法和非競爭法，其中，競爭法包括直接競爭法和間接競爭法，非競爭法包括雙抗體夾心法及抗原和抗體直接結(jié)合法。

1、間接競爭法

間接競爭法主要是針對半抗原的檢測，因為常規(guī)的基于標記的免疫分析方法不適合檢測小分子物質(zhì)。該方法通常將抗原與蛋白質(zhì)（如牛血清蛋白）的結(jié)合物固定在固相表面，待測液中游離的抗原與被固定的抗原競爭結(jié)合游離的過量抗體，移去溶液中的抗原-抗體結(jié)合物，標記二抗再與固相表面的抗體（已和被固定的抗原結(jié)合)結(jié)合。標記物可以是酶、熒光或其他用于信號放大的物質(zhì)。 

圖片來源：IVD分享庫，Bin仔繪制

當樣品中游離抗原的濃度較高時，與固相載體表面固定的抗原結(jié)合的抗體就越少，相應地與之結(jié)合的標記二抗就越少，標記物產(chǎn)生的響應信號（如電流）就越小，由此建立響應信號與目標抗原濃度之間的關(guān)系。該方法中一個抗體分子能同時結(jié)合多個二抗分子，使信號放大效果大大增強，提高檢測的靈敏度。該方法包含的主要步驟包括抗原抗體溫育、清洗、二抗溫育、信號檢測。

2、直接競爭法

直接競爭法既可以基于抗原（或抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合物）的固定，也可以基于抗體的固定。在基于抗原的固定方式中，游離的抗原與被固定的抗原競爭結(jié)合標記抗體，經(jīng)過清洗步驟后檢測抗體標記物所引起的響應信號的變化。與間接競爭免疫法相比，該方法對抗體進行標記，減少了使用標記二抗結(jié)合的步驟，但同時，標記抗體的成本較高，且不如標記二抗的信號放大效果強。） 

圖片來源：IVD分享庫，Bin仔繪制

同理，在基于抗體固定的方式中，游離的抗原和標記抗原競爭結(jié)合被固定的抗體，經(jīng)過清洗步驟除去未結(jié)合的標記抗原。這種方法包含溫育、清洗、信號檢測三個主要步驟。該方法存在的問題在于，當目標抗原濃度較低時，參與競爭的標記抗原引起的信號響應相對很大，待測信號的變化很小，使得檢測的靈敏度不高；另外，該方法中使用的標記物應避免對游離抗原親和性的影響。

3、雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是一種非競爭方法，需要一抗和二抗兩種抗體。二抗只能與相應的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，不能與一抗結(jié)合。樣品中的抗原與固定在固相表面的抗體（即一抗）結(jié)合形成抗原-抗體結(jié)合物，經(jīng)清洗后，標記二抗與抗原結(jié)合，形成“第一抗體-抗原-第二抗體"的雙抗夾心結(jié)構(gòu)，檢測標記物產(chǎn)生的響應信號。

圖片來源：IVD分享庫，Bin仔繪制

與競爭免疫分析模式相比，該方法需要固相抗體與標記二抗共同對目標抗原進行特異性識別，減少了非特異性結(jié)合帶來的干擾，因此該方法的特異性和靈敏度更高，檢測下限更低。該方法一般適用于檢測生物大分子，小分子抗原由于沒有足夠的結(jié)合位點同時結(jié)合一抗和二抗，不適合采用該方法。

4、抗原和抗體直接結(jié)合法

直接結(jié)合的非競爭免疫分析方法將抗體或抗原固定在固相表面，待測抗原或抗體被捕獲后引起響應信號的變化。該方法需要考慮非特異性吸附和背景干擾等問題。

直接結(jié)合法示意圖