單細(xì)胞蛋白分析是一條可以更深入的了解免疫應(yīng)答、信號傳導(dǎo)、靶向治療的途徑。微流控芯片和免疫分析的出現(xiàn)為單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供了新平臺。單細(xì)胞免疫印跡法（scWB）是一種可對單細(xì)胞表面、胞內(nèi)和核內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行多重檢測的方法。它結(jié)合了基于微芯片的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法（SDS-PAGE）和凝膠內(nèi)蛋白質(zhì)光捕獲及免疫探針方法。然而，由于原位免疫印跡的特殊性，scWB常常無法檢測低豐度的蛋白質(zhì)。凝膠內(nèi)免疫探測的成功在很大程度上取決于蛋白質(zhì)的固定化效率。目前，一種典型的光親和標(biāo)記二苯甲酮（BP）可以形成光敏性聚丙烯酰胺凝膠，已廣泛用于光捕獲和凝膠內(nèi)免疫探測儀中。然而，其光衍生的中間體目標(biāo)捕獲率低,且會導(dǎo)致目標(biāo)熒光信號模糊等問題。
為了克服單細(xì)胞免疫印跡方法中的信號背景增強(qiáng)這一瓶頸，近，有報(bào)道稱2-芳基-5-羧基四唑-賴氨酸的類似物是一種良好的光親和標(biāo)記材料，可用于蛋白質(zhì)靶標(biāo)的原位固定和特異性位點(diǎn)結(jié)合。在這些類似物中，（1-甲基-1H-吡咯-2-基）-2H-四唑-5甲酰胺（mPyTC）與傳統(tǒng)的光活化基團(tuán)（包括芳基酮，芳基疊氮化物和二疊氮基）相比，在選擇性蛋白質(zhì)靶標(biāo)標(biāo)記中顯示出更強(qiáng)的特異性。
受這些工作的啟發(fā)，作者在此提出了一種合適的聚丙烯酰胺交聯(lián)四唑基團(tuán)，作為一種高效率、高選擇性的光活性水凝膠用于凝膠內(nèi)蛋白質(zhì)的光固定化。
基本信息
題目：A Photoclick Hydrogel for Enhanced Single-Cell Immunoblotting
期刊：Advanced Functional Materials
影響因子：16.836
通訊作者：丁顯廷教授，謝海洋助理研究員
索萊寶合作產(chǎn)品：
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 |
FITC-BSA | SF063 |
FITC-OVA | SF069 |
摘 要
單細(xì)胞免疫印跡法的研究進(jìn)展引起了人們的廣泛關(guān)注，該方法有助于探索從癌癥發(fā)展到干細(xì)胞生物學(xué)等影響生物系統(tǒng)的細(xì)胞間變異。該文章報(bào)道了一種用于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析的四唑功能化光敏感水凝膠。該凝膠利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳作為分子篩基質(zhì)用于交聯(lián)免疫印跡凝膠內(nèi)的蛋白質(zhì)。在很短時間（60s）的長波長紫外線照射下，能有效地將電泳分離的蛋白質(zhì)捕獲到凝膠中，用于隨后的抗體原位孵育。文章利用該方法研究了不同藥物處理的GES-1/MGC803細(xì)胞系中糖蛋白細(xì)胞間表達(dá)的差異性。與單細(xì)胞免疫印跡法相比，應(yīng)用該光敏感凝膠可同時監(jiān)測約2000個細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，這些細(xì)微變化用傳統(tǒng)技術(shù)可能是檢測不到的。該凝膠具有良好的電泳分離能力、良好的蛋白質(zhì)光固定化效率、較低的自發(fā)熒光背景，其優(yōu)良性能使其在毛細(xì)管、微流控芯片原位免疫印跡分析中具有廣闊的應(yīng)用前景，為應(yīng)用單細(xì)胞免疫印跡分析技術(shù)研究低豐度蛋白的研究人員提供了解決方案。
研究內(nèi)容與結(jié)果
1、MMP凝膠的合成與特征
文章作者開發(fā)了用于SDS-PAGE和凝膠免疫印跡的四唑功能化聚丙烯酰胺（圖1）。首先以N-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺為原料合成了功能性光捕獲產(chǎn)物2-（1-甲基-1H-吡咯-2-基）-2H-四唑-5-羧基羧酸。通過EDCl/HOBt催化的酰胺縮合反應(yīng)得到N-（3-甲基丙烯酰胺丙基）-2-（1-甲基-1H-吡咯-2-基）-2H-四唑-5-羧酰胺（MAP-mPyTC）（圖2a）。將合成的MAP-mPyTC與丙烯酰胺和N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺共聚，形成mPyTC修飾的聚丙烯酰胺（MMP）凝膠。產(chǎn)生的凝膠可以通過光敏感加成反應(yīng)共價固定電泳分離的蛋白質(zhì)（圖2b）?；谝韵驴紤]，MMP凝膠是理想的光敏感水凝膠：首先，四唑基具有較高的中間親電性，因此具有高效率光捕獲蛋白的特性。第二，光衍生的羧基腈亞胺中間體與近端親核試劑，導(dǎo)致O-N?；D(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生特定的光加合物。后，當(dāng)親核試劑不可用時，光衍生的羧基腈亞胺中間體會迅速淬滅，限制自發(fā)熒光并降低背景。
圖1
MAP-mPyTC的紫外可見光譜在346nm處呈現(xiàn)一個峰值，是其的紫外激發(fā)波長。以此，用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的牛血清白蛋白（BSA）評估了MMP凝膠固定光誘導(dǎo)蛋白性能。圖2c表明MMP在正常的電泳條件下，凝膠在不暴露于紫外線時仍保持穩(wěn)定性。圖2d表明只需要60s的紫外線照射MMP凝膠就能光固定蛋白質(zhì)。此外，MMP凝膠優(yōu)于先前報(bào)道BPMAC約85％的光捕獲效率。
作者進(jìn)一步研究了固定光誘導(dǎo)蛋白的分子范圍，并通過結(jié)合各種分子量（BSA，卵清蛋白[OVA]，胰蛋白酶抑制劑[TI]和溶菌酶）的蛋白質(zhì)靶標(biāo)而擴(kuò)大了靶標(biāo)庫。在60s內(nèi)成功捕獲了所有蛋白質(zhì)靶標(biāo)，并且在分子量較小的情況下，捕獲動力學(xué)遵循相同的指數(shù)模式（圖2e）。在條件下（紫外線激發(fā)時間：60s，MAP-mPyTC濃度：0.6mM），作者觀察到蛋白質(zhì)靶標(biāo)明顯固定在MMP凝膠上，效率分別為92.77±1.35％，分別為91.16±3.91％，86.45±2.81％和82.36±4.44％。
圖2
2、MMP凝膠的免疫印跡分離性能驗(yàn)證
接下來，對MMP凝膠的性能進(jìn)行了測試。掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示凍干光敏感凝膠中清晰的多孔結(jié)構(gòu)（圖3a，左）。用Image J測量孔徑，結(jié)果表明MMP凝膠的孔徑與普通凝膠PA凝膠相似，而BP-PA凝膠的孔徑較?。▓D3a，右）。然后，基于這一理論作者研究了MMP凝膠的分離性能，結(jié)果表明，在電泳過程中總丙烯酰胺濃度的變化（%T，凝膠孔徑的調(diào)整）要優(yōu)于篩選蛋白質(zhì)靶大小。與PA和BP-PA凝膠電泳相似，觀察到MMP凝膠電泳具有較好的分離分辨率（圖3b）?？偟膩碚f，在電泳30s后MMP凝膠顯示了五種物種的良好分離。
凝膠內(nèi)免疫檢測的另一個瓶頸是水凝膠自熒光干擾，這是用于檢測靈敏度低的原位免疫印跡方法一個主要的瓶頸。為了檢測自體熒光對檢測靈敏度的影響，以牛血清白蛋白作為驗(yàn)證靶，用抗牛血清白蛋白一抗和相應(yīng)的二抗在凝膠中進(jìn)行檢測。從熒光圖像中觀察到，BP-PA凝膠中的背景熒光信號明顯較高（圖3d）。而分析物MMP中條帶信號較強(qiáng)（圖3e），信噪比顯著提高（圖3f）。此外，選擇性更高的官能團(tuán)顯著避免了非特異性的結(jié)合。
圖3
3、MMP凝膠scWB的性能測試
作者采用常規(guī)流程（圖4a）來確定scWB的穩(wěn)定性，同時使用MMP凝膠分析了GES-1-GFP/GES-1細(xì)胞系和MGC803-GFP/MGC803細(xì)胞系的生物樣本（圖4b，c）。結(jié)果顯示GES-1-GFP/MGC803-GFP組和陰性對照組與常規(guī)免疫熒光成像和流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果相似（圖4d），紫外線對光捕獲靶抗原無不良影響，與其他mPyTC衍生物介導(dǎo)的蛋白質(zhì)研究相一致。
P-糖蛋白（P-gp）是ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的成員外排蛋白，與化療耐藥有關(guān)。研究P-gp表達(dá)譜的細(xì)胞間差異有助于闡明耐藥的潛在機(jī)制。為進(jìn)一步驗(yàn)證所制備的MMP凝膠的對目標(biāo)蛋白的檢測能力，利用誘導(dǎo)劑（利福平）或抑制劑（維拉帕米）處理GES-1/MGC803細(xì)胞系，通過scWB對P-gp進(jìn)行檢測其在細(xì)胞間的差異性。
Q-P-gp在MGC803腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)高于GES-1正常胃粘膜上皮細(xì)胞（圖4e）。利福平誘導(dǎo)組和維拉帕米抑制組的P-gp在GES-1細(xì)胞中的表達(dá)有顯著差異。結(jié)果表明，MGC803腫瘤細(xì)胞比正常GES-1細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐藥性，P-gp在GES-1細(xì)胞中的表達(dá)更易受到化學(xué)物質(zhì)的影響?；贛MP的scWB顯示的組間差異在傳統(tǒng)的免疫印跡分析中是觀察不到的。值得注意的是，在BP-PA凝膠中，維拉帕米治療組P-gp蛋白的熒光信號大多被光敏凝膠的背景熒光所掩蓋，但在MMP凝膠中卻可以清楚地觀察到（圖4f）。這些結(jié)果表明，作者提出的光敏感凝膠在單細(xì)胞分辨率下描繪了低豐度蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，可以提供以往方法無法獲得的細(xì)胞間特異性。
圖4
研究結(jié)論與意義
綜上所述，該文章報(bào)道了一種mPyTC修飾的光敏感聚丙烯酰胺凝膠，克服了單細(xì)胞蛋白免疫印跡分析中背景熒光信號強(qiáng)的這一瓶頸。在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，該方法無需熒光信號放大，即可定量分析低豐度蛋白質(zhì)（≈30000個蛋白質(zhì)分子）。利用光敏感丙烯酰胺凝膠，能夠同時監(jiān)測約2000個單細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平，文章中分析了GES-1/MGC803細(xì)胞系P-糖蛋白表達(dá)的細(xì)胞間差異。本文所提出的光敏感水凝膠的優(yōu)點(diǎn)包括易于合成、良好的電泳分離能力、較高蛋白質(zhì)光固定效率、較低自熒光性，因此，可以用作毛細(xì)管和微流控原位免疫印跡分析的光活性聚丙烯酰胺凝膠的替代。
索萊寶產(chǎn)品亮點(diǎn)
相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 |
FITC-BSA | SF063 |
FITC-OVA | SF069 |
牛血清白蛋白 BSA-Ⅴ | A8020 |
牛血清白蛋白 BSA(全組分) | A8010 |
Anti-GFP tag Monoclonal Antibody | K200047M |
Anti-GFP-Tag Polyclonal Antibody | K009323P |
羊抗小鼠IgG(純化) | SPA131 |
羊抗小鼠IgG(免疫血清) | SA131 |
羊抗兔IgG(純化) | SPA134 |
羊抗兔IgG(免疫血清) | SA134 |
優(yōu)級胎牛血清 | S9020 |
細(xì)胞融合胎牛血清 | 11061-8611 |
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