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NADPH-細(xì)*色素C還原酶（NCR）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

可見(jiàn)分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。

貨號(hào)：BC2720

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前取一瓶加入50mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑2-8℃保存可保存4周；

2、 試劑三：臨用前取一瓶加入1.3mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融。

3、 試劑四：臨用前取一支加入275μL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說(shuō)明：

細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。NCR作為P450酶系的重要一員，催化氧化型P450還原再生。

NCR催化NADPH還原氧化型細(xì)*色素C，還原型細(xì)*色素C在550nm處有特征吸收峰；通過(guò)測(cè)定550nm吸光度的增加速率，來(lái)計(jì)算NCR活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋、低溫離心機(jī)、超速離心機(jī)、研缽/勻漿器、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提?。蛇m當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、除去細(xì)胞核和線粒體等：稱約0.5g組織，加入4℃預(yù)冷的1mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g，4℃離心30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。

2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加0.5mL試劑二，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，置于冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 臨用前根據(jù)實(shí)驗(yàn)用量取出部分試劑二在37℃水浴中預(yù)熱30min。

3、空白管：取1mL玻璃比色皿，依次加入50μL蒸餾水、900μL試劑二、50μL試劑三和10μL試劑四，迅速混勻后于550nm處測(cè)定2min內(nèi)吸光值變化，測(cè)定第10s和第130s吸光值，分別記為A1、A2。計(jì)算ΔA空白=A2-A1。空白管只需做1-2次。

4、測(cè)定管：取1mL玻璃比色皿，依次加入50μL粗酶液、900μL試劑二、50μL試劑三和10μL試劑四，迅速混勻后于550nm處測(cè)定2min內(nèi)吸光值變化，測(cè)定第10s和第130s吸光值，分別記為A3、A4。計(jì)算ΔA測(cè)定=A4-A3。

三、NCR活性計(jì)算

1、按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃條件下，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原型細(xì)*色素C為1個(gè)酶活單位。

NCR (U/mg prot)= (ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

= 0.529×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃條件下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原型細(xì)*色素C為1個(gè)酶活單位。

NCR (U/g 質(zhì)量)= (ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=0.265×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷W

ε：還原型細(xì)*色素C摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，1010μL=0.00101L；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；V樣：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積，50μL=0.05mL；V樣總：樣本處理中最后加入試劑二體積，0.5mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2min。

注意事項(xiàng)：

1、如果測(cè)定吸光值A＞1.2或ΔA＞0.8，建議稀釋樣本后再測(cè)定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2、如果測(cè)定吸光值較低或接近空白OD值，建議增加樣本量后再進(jìn)行測(cè)定，注意同步修改計(jì)算公式。

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