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大鼠血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）ELISA試劑盒

注意事項： 

1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。 

2. 試劑盒未使用時應(yīng)保存在 2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請丟棄。 

3. 試劑盒使用前請在室溫恢復(fù) 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。 

4. 在試驗中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測，且加入試劑的順序應(yīng)保持*。

 5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。.

 6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運(yùn)輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶 蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹 打幾次。 

7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的 試劑代替本試劑盒中的某單個組分。 

8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 

安全提示：

 試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護(hù)；在操作過程中也要避免試 劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物 實驗室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。

自備實驗器材（不提供，可代購） 

1． 酶標(biāo)儀（主波長 450nm，參考波長 630nm） 

2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl 

3． 洗板機(jī)或洗瓶 

4． 37℃孵育箱 

5． 雙蒸水，去離子水，量筒等

 6． 稀釋用聚丙烯試管 

大鼠血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）ELISA試劑盒

樣本收集及儲存： 

1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清： 將細(xì)胞培養(yǎng)基移無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于 -20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。

2. 血清樣本： 室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于 -20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復(fù)凍融。

3. 血漿樣本： 將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混 合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。 

※注意：

血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高 于標(biāo)準(zhǔn)品的值，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實驗前做預(yù)實驗以確定稀釋倍數(shù)。 

試劑準(zhǔn)備：

 1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入 37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。 

2. 配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋 成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。

 3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）0.5ml凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其*溶解后 輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后按照以下濃度： 2000、 1000、500、250、125、62.5、31.25、0 pg/ml進(jìn)行稀釋。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（2000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并 將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍 應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。 

5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1 倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內(nèi)使用。 

VEGF Rat ELISA Kit

結(jié)果判斷：

 1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長檢測，請 用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。 

2.計算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值：每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值 

3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中VEGF含量可通過對應(yīng)OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。 

4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù)。

1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

2. 靈敏度：

 低可檢測大鼠 VEGF 濃度達(dá) 15pg/ml， 20 個零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個標(biāo)準(zhǔn)差，計算相應(yīng)的可檢測濃度。 

3. 特異性：

不與大鼠 GM-CSF、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、 IL-18、LIX、MAC/Fc、TIMP-1、TNF-α 等反應(yīng) 

4. 重復(fù)性：

板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%

5. 回收率： 

在選取的健康大鼠血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的大鼠 VEGF，計算回收率。

6. 線性稀釋： 分別在選取的 4 份健康大鼠血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度大鼠 VEGF，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行 稀釋，評估線性。 

血管內(nèi)皮生長因子