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推薦抗體純化使用的方法
最近更新時(shí)間：2011-3-21
提 供 商：上海研生實(shí)業(yè)有限公司資料大?。?/span>0K
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純化抗體通常用于直接檢測抗原。此時(shí)抗體標(biāo)記有一個(gè)易于鑒定的標(biāo)記物，用于結(jié)合和檢測所研究的抗原。在間接檢測抗原方法中，一抗不被標(biāo)記，而是用標(biāo)記的二抗（一種抗免疫球蛋白抗體）來檢測。一般而言，建議使用間接法。因?yàn)樵S多商家能夠提供可靠的標(biāo)記二抗，用間接法不僅省力，結(jié)果同樣可靠。盡管如此，有幾種方法需要標(biāo)記的一級抗體。例如，在免疫染色試驗(yàn)中，需要研究2個(gè)或2個(gè)以上抗原的相對位置時(shí)，常需要純化抗體并用不同標(biāo)記物標(biāo)記，這樣能比較它們的相對位置。此時(shí)使用間接法不合適。因?yàn)殚g接法是用標(biāo)記二抗來給未標(biāo)記的一抗定位。又如，有時(shí)一抗需要標(biāo)記，而該樣本中又有大量無關(guān)抗體，它們能干擾對一抗的檢測，此時(shí)用間接法也不合適。用鼠源性單抗對鼠組織抗原進(jìn)行定位時(shí)，也會出現(xiàn)這種情況。此時(shí)需要純化一抗，并直接按下述方法進(jìn)行標(biāo)記。免疫親和純化是另一種可能需要純化抗體的技術(shù)。在這一技術(shù)中，抗體共價(jià)交聯(lián)到一固相基質(zhì)上，如交連的瓊脂糖或聚丙烯酰胺微球。常用的方法是，先將抗體純化，然后連接到通過化學(xué)方法激活而具有結(jié)合位點(diǎn)的微球上。此時(shí)，抗體的純化對實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。還有一種需要純化抗體的試驗(yàn)，是從多克隆抗血清中分離抗原特異性抗體。多克隆血清中含有復(fù)雜多樣的抗體，它不僅含有針對免疫原產(chǎn)生的抗體，還有血清的全部抗體。出于特定目的的需要，必須將抗原的特異性抗體分離出來。例如使用抗肽抗體時(shí)，需要分離出特異性識別肽段的抗體。通過純化能獲得特異性很高的抗體。純化抗體的另一用途是降低本底。幾乎在所有技術(shù)中，使用純化抗體都能降低非特異性本底。產(chǎn)生這種效果主要是因?yàn)橐环矫婺苋コ饘?shí)驗(yàn)誤差的污染蛋白。
另一方面能控制實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生陽性信號的抗體量。使用純化抗體不會使本底增加，因此純化抗體可以作為所有免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)中降低本底的基本手段?？贵w的純化通常是濃縮抗體的zui簡單方法。任何來源的抗體可以用蛋白A或蛋白G的純化方法來濃縮。 盡管純化抗體的方法較多，建議用蛋白A或蛋白G微球純化法作為zui常用的方法。這種方法效率高，能為常用的實(shí)驗(yàn)方法提供足夠純化的抗體，而且隨著商品化的蛋白A和蛋白G基質(zhì)的出現(xiàn)，能將任何來源的抗體純化。抗體的純化也可采用傳統(tǒng)的色譜法，在某些情況下非常有用。這些方法包括DEAE離子交換色譜法、硫酸銨沉淀法及其他方法。但是用蛋白G或蛋白A親和柱法純化較其他方法簡單，并且純化效果是其他方法的數(shù)倍。因此在所有方法中，我們推薦這種方法。有一種情況不適于應(yīng)用蛋白G或蛋白A親和柱純化抗體，即多克隆抗體需要進(jìn)一步分離，且針對某種特異性抗原的組分需要分離。此時(shí)可用抗原結(jié)合的親和柱純化抗原特異性抗體。