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綠色熒光蛋白-用途

最近更新時(shí)間：2011-5-5

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www.hbwxwy.cn/st175729/product_4537662.html在細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域中，綠色螢光蛋白基因常被用作為一個(gè)報(bào)導(dǎo)基因（reporter gene）。一些經(jīng)修飾過的型式可作為生物探針，綠色螢光蛋白基因也可以克隆到脊椎動(dòng)物（例如:兔子上進(jìn)行表現(xiàn)，并拿來映證某種假設(shè)的實(shí)驗(yàn)方法。

1．分子標(biāo)記
作為一種新型的報(bào)告基因，GFP已在生物學(xué)的許多研究領(lǐng)域得到應(yīng)用。利用綠色熒光蛋白*的發(fā)光機(jī)制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽（protein tagging），即利用DNA重組技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，然后借助熒光顯微鏡便可對(duì)標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活體觀察。由于GFP相對(duì)較小，只有238個(gè)氨基酸，將其與其他蛋白融合后不影響自身的發(fā)光功能，利用GFP的這一特性已經(jīng)加深了我們對(duì)細(xì)胞內(nèi)一些過程的了解，如細(xì)胞分裂、染色體復(fù)制和分裂，發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。1996年，Ehrdardt等人報(bào)道了利用GFP的特性研究細(xì)胞分化蛋白FtsZ的定位。研究顯示FtsZ在細(xì)胞分裂位點(diǎn)形成了一個(gè)環(huán)狀物，且至少有9種蛋白在細(xì)胞分裂中起重要作用，盡管對(duì)這些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已經(jīng)搞清楚了它們聚合的順序以及在蛋白定位中的一些特征。利用GFP來檢測(cè)目標(biāo)蛋白的定位已為我們提供了一種對(duì)細(xì)胞內(nèi)的一些基本的生理過程進(jìn)行更詳盡觀察的新方法。
除用于特定蛋白的標(biāo)記定位外，GFP亦大量用于各種細(xì)胞器的標(biāo)記如細(xì)胞骨架、質(zhì)膜、細(xì)胞核等等。Shi等人曾報(bào)道將GFP融合到大腸桿菌細(xì)胞膜表面用作標(biāo)記蛋白，這一技術(shù)將有助于提高多肽庫(kù)的篩選效率、疫苗的研制、構(gòu)建細(xì)胞生物傳感器用作環(huán)境檢測(cè)以及探測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程等等。這些都為傳統(tǒng)生物學(xué)研究提供了新思路和新方法，成為交叉學(xué)科研究的熱點(diǎn)。
2．藥物篩選
許多新發(fā)展的光學(xué)分析方法已經(jīng)開始利用活體細(xì)胞來進(jìn)行藥物篩選，這一技術(shù)能從數(shù)量眾多的化合物中快速篩選出我們所感興趣的藥物。基于細(xì)胞的熒光分析可分為三類：即根據(jù)熒光的密度變化、能量轉(zhuǎn)移或熒光探針的分布來研究目標(biāo)蛋白如受體、離子通道或酶的狀態(tài)的變化。熒光探針分布是利用信號(hào)傳導(dǎo)中信號(hào)分子的遷移功能，將一熒光蛋白與信號(hào)分子相偶聯(lián)，根據(jù)熒光蛋白的分布情況即可推斷信號(hào)分子的遷移狀況，并推斷該分子在遷移中的功能。由于GFP分子量小，在活細(xì)胞內(nèi)可溶且對(duì)細(xì)胞毒性較小，因而常用作熒光探針。
在細(xì)胞體內(nèi)分子之間的相互作用非常復(fù)雜，其中很多涉及到信號(hào)分子在細(xì)胞器之間的遷移。例如當(dāng)信號(hào)分子和某一特殊受體結(jié)合后常會(huì)導(dǎo)致配體-受體復(fù)合物從某一細(xì)胞區(qū)域遷移到另一區(qū)域，而這一遷移過程通常會(huì)介導(dǎo)一重要的生理功能。因而，這些受體常常被用作藥物篩選的目標(biāo)，若某一藥物具有與信號(hào)分子類似的功能，那么該藥物即具有潛在的醫(yī)藥價(jià)值。利用GFP熒光探針，將很容易從數(shù)量眾多的化合物中判斷出那些化合物具有與信號(hào)分子相似的能引起配體一受體復(fù)合物遷移并介導(dǎo)生理反應(yīng)的功能，且這一篩選過程簡(jiǎn)單方便，所需成本也很低。利用這一原理，已經(jīng)成功構(gòu)建了一個(gè)篩選模型用于研究藥物介導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素受體（hGR）的遷移過程。在一96孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，并以一編碼hGR GFP蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞用待篩選的藥物處理后，hGR-GFP從細(xì)胞質(zhì)遷移人細(xì)胞核的過程可實(shí)時(shí)或在某一時(shí)段內(nèi)被證實(shí)，根據(jù)熒光分布即可推斷哪一種藥物具有與hGR配體相類似的功能。利用GFP來進(jìn)行藥物篩選由于受其必須與遷移的信號(hào)分子相偶聯(lián)，其篩選容量相對(duì)較低，但是由于GFP在細(xì)胞內(nèi)的穿透性強(qiáng)及*的發(fā)光機(jī)制，因而在藥物篩選中具有相當(dāng)大的應(yīng)用潛力。

3．融合抗體
近二十年來，抗體生成技術(shù)有了飛速發(fā)展，已經(jīng)從細(xì)胞工程抗體（雜交瘤技術(shù)一單克隆抗體）發(fā)展到了第三代抗體：基因工程抗體，尤其是噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的出現(xiàn)，解決了人源抗體的研制問題，促進(jìn)了各種性能優(yōu)良抗體以及具有多種功能的抗體融合蛋白的開發(fā)。單鏈抗體（Single-chain variable fragment，ScFv）是研究得較多的一種小分子抗體，其*陛在于可在宿主細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)，易于基因工程操作，尤其易于構(gòu)建抗體融合蛋白。近年來，關(guān)于綠色熒光蛋白融合單鏈抗體的報(bào)道很多，國(guó)內(nèi)也有相關(guān)報(bào)道，如程虹等報(bào)道將抗肝癌單鏈雙功能抗體融合GFP真核表達(dá)載體并導(dǎo)人小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3表達(dá)并獲得成功。因融合抗體具有與抗原結(jié)合及發(fā)射熒光兩種特性，故這一人工分子可用做免疫染色的檢測(cè)試劑，直接應(yīng)用于流式細(xì)胞儀和免疫熒光的標(biāo)記及腫瘤的檢測(cè)等等。
由于技術(shù)上的的原因，一般融合抗體均置于原核表達(dá)系統(tǒng)如E.coli中表達(dá)。為便于表達(dá)蛋白的分離純化，一般在單鏈抗體的N端或C端插入一6×His序列，便于用Ni-NTA親和層析柱純化目標(biāo)蛋白。但這一技術(shù)也存在一些問題。由于抗體分子內(nèi)存在二硫鍵，而在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)由于抗體不能正確折疊，容易形成包涵體，表達(dá)出來的目標(biāo)蛋白無活性，需要在氧化還原體系中進(jìn)行復(fù)性。但近來也有報(bào)道在動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中成功表達(dá)出具有抗原結(jié)合活性的單鏈抗體。若能成功解決融合抗體的表達(dá)問題，則在免疫染色及腫瘤檢測(cè)這一領(lǐng)域融合抗體將扮演極為重要的角色。
4．生物傳感器
蛋白質(zhì)工程技術(shù)已經(jīng)開始采用將一具有信號(hào)傳導(dǎo)功能分子識(shí)別位點(diǎn)的分子結(jié)合到另一分子上來設(shè)計(jì)生物感受器。綠色熒光蛋白由于其*的光信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，以及在表達(dá)后易被周圍化學(xué)環(huán)境和蛋白之間的相互作用所影響的特性，因而極適于用做活細(xì)胞體內(nèi)的光學(xué)感受器。*個(gè)基于GFP的生物感受器為Ca2+感受器，由Romoser和Miyawaki幾乎同時(shí)提出。這一感受器原理是利用鈣調(diào)蛋白結(jié)合鈣離子后引起的空間構(gòu)象變化導(dǎo)致兩種GFP突變體間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。但是由于大多數(shù)蛋白不能像鈣調(diào)蛋白那樣承受較大的空間構(gòu)象變化，為克服這一缺點(diǎn)，人們開始提出利用基因融合技術(shù)將一新的分子識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合到GFP上以構(gòu)建新的分子感受器。Doi和Yanagawa根據(jù)這一原理將TEM1 β-內(nèi)酰胺酶（Bla）融合到GFP上。當(dāng)缺少目標(biāo)分子時(shí)，GFP處于靜止?fàn)顟B(tài)不會(huì)產(chǎn)生熒光。但是當(dāng)目標(biāo)分子β-內(nèi)酰胺酶抑制蛋白（BLIP）與Bla結(jié)合后，即使GFP活化產(chǎn)生熒光，而這一變化很容易被檢測(cè)到。將受體蛋白插入到GFP表面的技術(shù)已經(jīng)成為構(gòu)建分子感受器的有力工具，這種GFP感受器能被用來檢測(cè)多種分子，如蛋白質(zhì)、核酸、激素、藥物、金屬及其他的一些小分子化合物等，其潛在應(yīng)用前景極為廣闊。

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