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細(xì)胞凋亡檢測-形態(tài)學(xué)特征的檢測方法

最近更新時(shí)間：2012-2-17

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一、普通光學(xué)顯微鏡觀察方法
1)蘇木素－伊紅染色(HE染色法)
石蠟組織切片的HE染色
1．取材組織塊，經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片。
2．切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗：二甲苯(I)5min→二甲苯(Ⅱ)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸餾水洗2min。
3．蘇木素染色5min，自來水沖洗。
4．鹽酸乙醇分化30s(提插數(shù)下)。
5．自來水浸泡15min或溫水(約50℃)5min。
6．置伊紅液2min。
7．常規(guī)脫水，透明，封片：95％乙醇(I)min→95％乙醇(Ⅱ)1min→100％乙醇(I)1min→100％乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3：1)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性樹脂封固。

2)甲基綠－派諾寧染色法
1．新鮮取材組織固定液中4℃固定3～6小時(shí)。
2．直接轉(zhuǎn)入95％乙醇脫水和無水乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。
3．切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化至蒸餾水。
4．置染色液中室溫下染片約1h。
5．取出切片，不經(jīng)水洗，用濾紙吸干多余染液。
6．插入丙酮中迅速分化。
7．轉(zhuǎn)入丙酮二甲苯(1：1)稍洗。
8．二甲苯透明2～3次。
9．中性樹膠封固。

3)Giemsa染色
1．收集細(xì)胞(1×106)，PBS洗1次。
2．用細(xì)胞涂片離心機(jī)制成細(xì)胞涂片。
3．甲醇固定3～5min。
4．入Giemsa稀釋染色液15～30min，冬天在37℃溫箱中染色。
5．用磷酸鹽緩沖液分色，以鏡下控制為準(zhǔn)。
6．涂片晾干后用中性樹膠封片。

4)瑞氏(Wright)染色
1．收集細(xì)胞(1×106)，PBS洗1次。
2．用細(xì)胞涂片離心機(jī)制成細(xì)胞涂片。
3．甲醇固定3～5min。
4．用Wright液染色2min。
5．入Wright磷酸緩沖液稀釋液4～10min，然后用蒸餾水沖洗。此時(shí)如果顏色較深，可0.08％醋酸分化數(shù)秒鐘
6．直立晾干后，用中性樹膠封固。

二、透射電子顯微鏡觀察方法
1)透射電鏡樣本的取材和固定
培養(yǎng)細(xì)胞的取材和固定
1．常規(guī)收集帖壁和懸浮細(xì)胞，置離心管中離心，800～1000r/min，10min。
2．用0.01mol/L PBS 5ml重懸細(xì)胞。
3．將細(xì)胞懸液吸入有瓊脂空槽的離心管中。
4．離心，2000r/min，15～20min，使細(xì)胞成團(tuán)。
5．小心吸去上清，加入2.5％戊二醛固定液固定細(xì)胞團(tuán)，以免細(xì)胞團(tuán)散開。
6．取出離心管內(nèi)的瓊脂，仔細(xì)切下尖槽內(nèi)含有細(xì)胞團(tuán)的瓊脂塊。
7．將含細(xì)胞的團(tuán)瓊脂塊投入含戊二醛固定液的小瓶中，4℃(可長期)保存。
8．用0.1mol/L PBS緩沖液洗1次。
9．1％鋨酸后固定30～60min。

三、熒光顯微鏡觀察方法
1)吖啶橙染色法
1．制備活細(xì)胞懸液，濃度約為107/ml。
2．取95μl的細(xì)胞懸液，加5μl的吖啶橙貯存液混勻。
3．吸一滴混合液點(diǎn)潔凈玻片上，直接用蓋玻片封片。
4．熒光顯微鏡選用激發(fā)濾片BG 12或BV等，阻斷濾片用515nm或SP3。

2)Hoechst33258染色法
1．原代細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞學(xué)涂片或細(xì)胞甩片機(jī)制備的單細(xì)胞片。
2．細(xì)胞固定液4℃固定5min。
3．蒸餾水稍洗后，點(diǎn)加Hoechst33258染色液，10min。
4．蒸餾水洗片后，用濾紙沾去多余液體。
5．封片劑封片后熒光顯微鏡觀察。

3)Hoechst33342染色法
1．將Hoechst33342加入培養(yǎng)的細(xì)胞中，終濃度為10μg/ml 37℃孵育30min。
2．4％的多聚甲醛和培養(yǎng)液以1：3混合，使多聚甲醛的濃度為1％，固定細(xì)胞5～10min。
3．固定好后，將細(xì)胞懸液涂在載玻片加蓋玻片。
4．熒光顯微鏡激發(fā)濾片選用UV激發(fā)濾片，阻斷濾片為400～500nm。

以上是先將細(xì)胞染色后再行固定觀察的方法，也可先固定后染色：
1．收集(0.5～3.0)×106個(gè)細(xì)胞，500～1000r/min，離心5min去上清。
2．PBS洗1次，500～1000r/min，離心5min去PBS。
3．用3％多聚甲醛50μl重懸細(xì)胞，室溫下固定10min。
4．PBS洗1次，500～1000r/min離心5min去PBS。
5．用15μl的Hoechst33258或33342重懸細(xì)胞，終濃度為16μg/ml，孵育15min。
6．取10μl放在玻片上，熒光顯微鏡下觀察，可數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算調(diào)亡率。
 

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