在初次接觸PCR儀時(shí)，小白們都會(huì)有各種各樣的困惑。譬如：PCR儀上的熱蓋和PCR管蓋作用一樣嗎？，不同品牌的熱蓋都是一樣的嗎？熱啟動(dòng)又是什么意義？?jī)蓚€(gè)加熱模式哪種情景適用？帶著這些問(wèn)題，小寶給大家一一解答！

01

*，PCR儀又稱熱循環(huán)儀，是配合PCR過(guò)程的變溫儀器，熱蓋是儀器上方的一部分，用來(lái)避免樣品在高溫環(huán)境下蒸發(fā)冷凝在管蓋上而減少反應(yīng)樣品體積的風(fēng)險(xiǎn)。

02

PCR又稱聚合酶鏈反應(yīng)，是體外擴(kuò)增目的DNA段的方法，在多方面廣泛應(yīng)用，主要分為三大步驟：高溫變性、低溫退火、適溫延伸。分別添加引物、模板、Taq酶、dNTP和緩沖液等反應(yīng)物混合，在約為95℃環(huán)境下，雙鏈DNA氫鍵斷裂解旋為單鏈；單鏈與人工設(shè)計(jì)的引物在約為60℃溫度下，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則相結(jié)合；并升溫到72℃左右，利用Taq酶延伸合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

03

在此過(guò)程中，某段溫度會(huì)接近或高于100℃，部分樣品會(huì)隨著高溫向上蒸發(fā)，遇上溫度較低的PCR管蓋，則會(huì)冷凝在管蓋上，管內(nèi)的樣品就會(huì)有一定損失，少一部分沒(méi)有參加循環(huán)，造成樣品得率降低。

在此之前儀器還不具備這個(gè)裝置，是通過(guò)樣品里滴加石蠟油來(lái)解決此問(wèn)題的，但實(shí)際上后續(xù)對(duì)石蠟油的處理較為繁瑣。后續(xù)熱蓋的出現(xiàn)能夠有效避免該風(fēng)險(xiǎn)，熱蓋的溫度一般都會(huì)比模塊高5-10℃，這樣模塊內(nèi)的PCR管上端溫度始終大于反應(yīng)液的溫度，由于高溫處壓強(qiáng)大于低溫處壓強(qiáng)，液體不會(huì)向上蒸發(fā)，于是所有的樣品反應(yīng)液體積不會(huì)發(fā)生變化。

04

但由于樣品管的高度不一，早期的儀器不可調(diào)熱蓋只能用于統(tǒng)一高度的樣品管，當(dāng)使用較矮的樣品管時(shí)，需要加入鋁塊，較為麻煩；目前可調(diào)式熱蓋分為旋鈕式和自調(diào)節(jié)式等：有些儀器旋鈕式熱蓋的高度和壓力是根據(jù)樣品管可調(diào)整：但換樣之前需要將旋鈕旋回原位。并且存在壓力不好控制的問(wèn)題：過(guò)緊會(huì)使樣品管變性等；過(guò)松則無(wú)法達(dá)到相應(yīng)溫度影響結(jié)果。自調(diào)節(jié)則可根據(jù)樣品管高低調(diào)節(jié)高度。

所謂熱啟動(dòng)則是在樣品管中添加的Taq酶用于適溫延伸這一步驟，但往往在室溫的環(huán)境下，Taq酶也能發(fā)揮作用，因此在加反應(yīng)物或是高溫變性前，都需要防止Taq酶在非適當(dāng)溫度下開(kāi)始工作，以避免該情況下非特異性產(chǎn)物。模板和酶數(shù)量一定，產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物，這說(shuō)明特異性產(chǎn)物含量會(huì)降低，因此，會(huì)在冰上加樣，或是先預(yù)熱PCR儀，再迅速放入PCR管。

還可以將凝固冷卻的蠟將引物，Mg²⁺，dNTP，和緩沖液混合和剩余反應(yīng)組分上、下層隔離開(kāi)來(lái)。在變性階段，蠟受熱熔化，所有成分混合，且液態(tài)蠟浮到樣品的上部，充當(dāng)熱蓋的作用，但后續(xù)蠟處理較為棘手。利用化學(xué)修飾或者制備抗原抗體復(fù)合物等方法使得其按照溫度高低控制酶活性。

石蠟熔化示意圖（管內(nèi)黃色部分為石蠟）

面對(duì)高通量的樣品，手動(dòng)熱啟動(dòng)防護(hù)會(huì)十分耗時(shí)，因此，PCR儀會(huì)設(shè)定熱蓋溫度，當(dāng)熱蓋加熱到一定溫度之前，模塊溫度保持不變；熱蓋溫度達(dá)到設(shè)定值時(shí)，模塊迅速升溫，達(dá)到熱啟動(dòng)的效果。

另外，很多PCR儀在加熱模式上有Tube、Block兩種方式可選。這是因?yàn)閮x器的溫度傳感器在模塊下部，實(shí)際上無(wú)法測(cè)得樣品管內(nèi)的溫度。一般情況（Block）下，在輸入設(shè)定溫度及運(yùn)行時(shí)間時(shí)，指的是模塊在到達(dá)溫度下持續(xù)相應(yīng)的時(shí)間，樣品管的溫度不能迅速達(dá)到的溫度；而Tube模式是先將模塊溫度高于設(shè)定溫度，等樣品管溫度到達(dá)溫度，再將模塊溫度降到溫度，這樣能快速使管內(nèi)溫度達(dá)到設(shè)定值。不同反應(yīng)體積和要求可使用不同的模式：普通PCR或體積較大使用Tube模式，當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間保溫且對(duì)溫度過(guò)沖要求較高或是體積較小時(shí)，可以使用Block模式。