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技術(shù)文章
單克隆抗體的基本原理和過程
點(diǎn)擊次數(shù)：6900 發(fā)布時(shí)間：2011-12-17
單克隆抗體的基本原理和過程
通過細(xì)胞融合技術(shù)將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，所產(chǎn)生的融合細(xì)胞既具有親本骨髓瘤細(xì)胞的無限繁殖的生物學(xué)特性，又具有另一親本B淋巴細(xì)胞合成、分泌特異性抗體的能力。應(yīng)用此技術(shù)從一個(gè)抗體分泌性B細(xì)胞雜交瘤分裂增殖，形成一個(gè)大的細(xì)胞克隆。由B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞克隆產(chǎn)生的只識(shí)別抗原分子上某一個(gè)抗原決定簇的純抗體，即單克隆抗體。單克隆抗體具有純度高、特異性強(qiáng)、利于實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化即可大量生產(chǎn)供應(yīng)等特點(diǎn)。
在單克隆抗體制備中，雖然除小鼠外其它動(dòng)物也可用于制備雜交瘤，但本書以小鼠為例來說明有關(guān)技術(shù)，同樣的技術(shù)也可用于大鼠骨髓瘤的融合及抗體篩選。對(duì)特殊動(dòng)物之間或與人細(xì)胞的融合，也有簡要說明。
單克隆抗體的制備是一個(gè)復(fù)雜、精細(xì)的工藝過程。為對(duì)全過程有一個(gè)概括的了解，先用表1 列出mAbs制備過程中的各個(gè)階段。一般將全過程分為三個(gè)階段：（1）免疫小鼠；（2）建立篩選方法和程序；及（3）雜交瘤生成。
表1 雜交瘤細(xì)胞生成的各個(gè)階段和所需時(shí)間
| 動(dòng)物免 疫階段 | | 初始免疫 | 兩周 | 一個(gè)月到一年 | |
| 10天 | 強(qiáng)化免疫 | ||||
| 血清測試 | | ||||
| 方法建 立階段 | | 篩選方法的建立與測試 | | zui少 兩周 | 大約一個(gè)月 |
| zui后一次強(qiáng)化免疫 | 三 天 | ||||
| 雜交瘤細(xì)胞生成階段 | 大約 一周 | 細(xì)胞融合 | | 大約一個(gè)月 | |
| 篩選陽性克隆 | | | |||
| | 陽性克隆擴(kuò)增及凍存 | | |||
| 大約 一周 | 單細(xì)胞的克隆生長 | | |||
| 篩 選 | 部分陽性細(xì)胞擴(kuò)增* | ||||
| 大部凍存（保留zui后所得的雜交瘤細(xì)胞） | |||||
*得到擴(kuò)增的陽性雜交瘤細(xì)胞后，可從其培養(yǎng)液中收集含單克隆抗體的上清液，進(jìn)行鑒定（其抗體含量為10-50µg/ml）；
*雜交瘤細(xì)胞也可進(jìn)行小鼠腹腔注射，以產(chǎn)生Mab含量高的腹水（其抗體含量為1-10mg/ml）。
以上每一階段都有可能迅速順利完成，但各階段也都有其本身的問題，需在實(shí)驗(yàn)開始前予以充分考慮，以免影響全局。以下分別進(jìn)行討論。動(dòng)物在注入抗原后，一旦出現(xiàn)良好的體液免疫應(yīng)答，同時(shí)又已建立合用的篩選方法，并通過血清對(duì)所建立篩選方法進(jìn)行評(píng)價(jià)、確定方法后，才可開始雜交瘤細(xì)胞的制備。其過程大致為：在細(xì)胞融合前數(shù)日，用抗原免疫動(dòng)物；將從免疫動(dòng)物得到的分泌抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞相混，進(jìn)行細(xì)胞融合（有效的細(xì)胞融合約可得1/105存活的雜交細(xì)胞）；其后，將融合細(xì)胞用所選擇的培養(yǎng)基限定稀釋，置多孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)。在細(xì)胞融合后一周，即可對(duì)雜交瘤進(jìn)行測試，從陽性培養(yǎng)孔所取的細(xì)胞先增殖，然后，進(jìn)行克隆化（即單克隆生長），雜交瘤的生成與克隆需要時(shí)間，很少的實(shí)例只需要兩個(gè)月，有的甚至要一年時(shí)間。因制備mAbs 過程中的每一步都對(duì)其后各步影響很大，因此均需注意選擇zui適宜的條件，如：
l 要注意抗原的選擇及其性質(zhì)，如細(xì)胞、蛋白質(zhì)、半抗原等；
l 根據(jù)抗原得性質(zhì)和得量和對(duì)抗體得要求等，計(jì)劃及建立免疫的途徑和方式；
l 選定篩選的方法：抗體篩選的測試方法必須簡單、可重復(fù)、特異，并可適用于mAb的zui終使用（即免疫熒光、免疫沉淀、功能試驗(yàn)等中的應(yīng)用）；
l 要確定細(xì)胞培養(yǎng)的條件；
l 進(jìn)行細(xì)胞融合的方式：包括雜交方法和細(xì)胞的選擇，和克隆的方式（限制性稀釋或軟膠法）等。
典型的單克隆抗體的制備過程為：
1． *次對(duì)每一小鼠注射500µl抗原與*福氏佐劑1：1的混和液（ip）。 共注6支BALB/c雌性小鼠（抗體的實(shí)際需用量見表2）；
2．14天后，再次注射，但改用抗原與不*福氏佐劑混合液；
3．第24天，從免疫小鼠尾靜脈取血，血清經(jīng)PBS 1：5稀釋，以同樣稀釋的正常血清為對(duì)照，用點(diǎn)雜交（Dot blot）法進(jìn)行測定；
4．第35天，所有小鼠均經(jīng)腹腔再注射抗原與不*福氏佐劑混合液；
5．第45天，取尾靜脈血，用點(diǎn)雜交法再次檢測。所有血清樣品均通過與在體同位素標(biāo)記的抗原進(jìn)行免疫沉淀法檢測；
6．第56天，對(duì)免疫應(yīng)答的小鼠再靜脈注射100µl 及腹腔注視100µl不*福氏佐劑抗原混合液，而對(duì)所有其余小鼠僅腹腔注射不*福氏佐劑抗原混合液；
7．第59天由免疫應(yīng)答的小鼠取脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合；
8．第66天，開始艱巨的工作，尋找*個(gè)陽性克隆的篩選。
*具體免疫抗原用量參見表2。
表2 抗原的參考用量
| 抗原類型 | 舉 例 | 初次免疫及加強(qiáng)免疫 | zui后加強(qiáng)免疫 |
| | | 抗原的劑量與方式 | 抗原的劑量與方式 |
| 可溶性蛋白 | 酶、多肽與載體蛋白 復(fù)合物、免疫復(fù)合物 | 5-50µg,+佐劑，ip或sc | 5-50µg, -佐劑，iv |
| 顆粒性蛋白 | 已殺死的病毒或酵母 或細(xì)菌，結(jié)構(gòu)蛋白 | 5-50µg,+佐劑，ip或sc | 5-50µg, -佐劑，iv |
| 不溶性蛋白 | 細(xì)菌包含體的產(chǎn)物 與固相小球結(jié)合的 經(jīng)免疫純化蛋白 | 5-50µg,+佐劑，ip或sc | 5-50µg, -佐劑，ip |
| 活 細(xì) 胞 | 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 | 105-107 細(xì)胞—佐劑，ip | 106 細(xì)胞, -佐劑，iv |
| 活癌源細(xì)胞 | 哺乳動(dòng)物癌源細(xì)胞 | 104-106 細(xì)胞—佐劑，ip | 106 細(xì)胞, -佐劑，iv |
| 糖 類 | 多糖、糖蛋白 | 5-50µg,+/-佐劑，ip或sc | 5-50µg, -佐劑，iv |
| 核 酸 | 核酸與載體蛋白復(fù)合物 | 5-50µg,+佐劑，ip | 5-50µg, -佐劑，iv |
ip 腹腔注射； sc 皮下注射；iv 靜脈注射
人員要求和儀器設(shè)備
雜交瘤得制備需要優(yōu)良的組織培養(yǎng)設(shè)備及訓(xùn)練有素、有經(jīng)驗(yàn)的專門技術(shù)人員。
培養(yǎng)雜交瘤及有關(guān)細(xì)胞所需設(shè)備有：
l 有專門空氣過濾裝置的細(xì)胞培養(yǎng)場所
l 有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所需條件
l 免疫用注視器和針頭
l 通風(fēng)櫥
l 濕度維持5-8%、37℃的CO2 孵箱
l 倒置顯微鏡（具有×10及 ×20物鏡，× 10-15 目鏡）
l 用于細(xì)胞記數(shù)的光學(xué)顯微鏡
l 紅細(xì)胞記數(shù)器
l 37℃水浴
l 洗細(xì)胞用低溫離心機(jī)
l 一次性塑料培養(yǎng)板（24孔和96孔）及培養(yǎng)瓶
l 15及50ml 消毒的聚丙烯錐形管
l 消毒1，2，5及10 ml 的吸管及吸液器
l 低溫冰箱（–80℃）及液氮罐
參考文獻(xiàn)
1．Galfre, G. And Milstein, C. （1981） Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedure. Methods in Enzymology. 73,3-46
2．瘤技術(shù)與單克隆抗體制備” 見巴德年主編 《當(dāng)代免疫學(xué)技術(shù)與應(yīng)用》pp.351-373 北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社 1998。
3．胞融合雜交及單克隆抗體技術(shù)” 見楊景山主編《醫(yī)學(xué)細(xì)胞化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)技》pp.452-469北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社 1992 。