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技術(shù)文章
膠體金技術(shù)介紹
點(diǎn)擊次數(shù)：14867 發(fā)布時(shí)間：2012-12-28
金免疫技術(shù)的特點(diǎn)是以膠體金作為標(biāo)記物。這一技術(shù)在70年代初期由Faulk和Taylor始創(chuàng)，zui初用于免疫電鏡技術(shù)。迄今為止，金標(biāo)記仍主要用于免疫組織化學(xué)中。在免疫測(cè)定中，金標(biāo)記常與膜載體配合，形成特定的測(cè)定模式，典型的如斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)和斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)等，已是目前應(yīng)用廣泛的簡(jiǎn)便、快速檢驗(yàn)方法。
*節(jié)免疫膠體金的制備
一、膠體金的特性和制備
（一）膠體金的結(jié)構(gòu)
膠體金（colloidalgold）也稱金溶膠（goldsol），是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子（AuC12－），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。膠體金顆粒的基礎(chǔ)金核并非是理想的圓球核，較小的膠體金顆?；臼菆A球形的，較大的膠體金顆粒（一般指大于30nm以上的）多呈橢圓形。在電子顯微鏡下可觀察膠體金的顆粒形態(tài)。
（二）膠體金的特性
1．膠體性質(zhì)膠體金顆粒大小多在1～100nm，微小金顆粒穩(wěn)定地、均勻地、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中，成為膠體金溶液。膠體金因而具有膠體的多種特性，特別是對(duì)電解質(zhì)的敏感性。電解質(zhì)能破壞膠體金顆粒的外周永水化層，從而打破膠體的穩(wěn)定狀態(tài)，使分散的單一金顆粒凝聚成大顆粒，而從液體中沉淀下來(lái)。某些蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)有保護(hù)膠體金、加強(qiáng)其穩(wěn)定性的作用。
2．呈色性微小顆粒膠體呈紅色，但不同大小的膠體呈色有一定的差別。zui小的膠體金（2～5nm）是橙黃色的，中等大小的膠體金（10～20nm）是酒紅色的，較大顆粒的膠體金（30～80nm）則是紫紅色的。根據(jù)這一特點(diǎn)，用肉眼觀察膠體金的顏色可粗略估計(jì)金顆粒的大小。
3．光吸收性膠體金在可見(jiàn)光范圍內(nèi)有一單一光吸收峰，這個(gè)光吸收峰的波長(zhǎng)（λmax）在510～550nm范圍內(nèi)，隨膠體金顆粒大小而變化，大顆粒膠體金的λmax偏向長(zhǎng)波長(zhǎng)，反之，小顆粒膠體金的λmax則偏于短波長(zhǎng)，表19-1所列為部分膠體金的λmax。
（三）膠體金的制備
1．制備方法膠體金的制備多采用還原法。氯金酸（HauC14）是主要還原材料，常用還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。根據(jù)還原劑類型以及還原作用的強(qiáng)弱，可以制備0.8nm～150nm不等的膠體金。zui常用的制備方法為檸檬酸鹽還原法。具體操作方法如下：
（1）將HauC14先配制成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸。
（2）攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入一定量的1％檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7•2H2O）水溶液。
（3）繼續(xù)加熱煮沸15min。此時(shí)可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過(guò)程約2～3min。
（4）冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積。
用此法可制備16～147nm粒徑的膠體金。金顆粒的大小取決于制備時(shí)加入的檸檬酸三鈉的量。表19-1列舉制備4種不同粒徑膠體金時(shí)檸檬酸三鈉的用量。
表19-1 四種粒徑膠體金的制備及特性
膠體金粒徑（nm） 1％檸檬酸三鈉加入量（ml）*膠體金特性
呈色 λmax
16 2.00 橙色 518nm
24.5 1.50 橙紅 522nm
41 1.00 紅色 525nm
71.5 0.70 紫色 535nm
*還原100ml0.01％HauC14所需量
2．注意事項(xiàng)
（1）氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。
（2）氯金酸對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，因此在配制氯金酸水溶液時(shí)，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。
（3）用于制備膠體金的蒸餾水應(yīng)是雙蒸餾水或三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水。
（4）是以制備膠體金的玻璃容器必須是清潔的，用前應(yīng)先經(jīng)酸洗并用蒸餾水沖凈。是經(jīng)硅化處理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數(shù)分鐘，用蒸餾水沖凈后干燥備用。
（5）膠體金的鑒定和保存：膠體金的制備并不難，但要制好高質(zhì)量的膠體金卻也并非易事。因此對(duì)每次制好的膠體金應(yīng)加以檢定，主要檢查指標(biāo)有顆粒大小，粒徑的均一程度及有無(wú)凝集顆粒等。
肉眼觀察是zui基本也是zui簡(jiǎn)單和方便的檢定方法，但需要一定的經(jīng)驗(yàn)。良好的膠體金應(yīng)該是清亮透明的，若制備的膠體金混濁或液體表面有漂浮物，提示此次制備的膠體金有較多的凝集顆粒。在日光下仔細(xì)觀察比較膠體金的顏色，可以粗略估計(jì)制得的金顆粒的大小。當(dāng)然也可用分光光度計(jì)掃描λmax來(lái)估計(jì)金顆粒的粒徑。結(jié)制備的膠體金作電鏡觀察，并選一些代表性的作顯微攝影，可以比較地測(cè)定膠體金的平均粒徑。
膠體金在潔凈的玻璃器皿中可較長(zhǎng)時(shí)間保存，加入少許防腐劑（如0.02％NaN3）可有利于保存。保存不當(dāng)時(shí)會(huì)有細(xì)菌生長(zhǎng)或有凝集顆粒形成。少量凝集顆粒并不影響以后膠體金的標(biāo)記，使用時(shí)為提高標(biāo)記效率可先低速離心去除凝集顆粒。
二、免疫金的特性和制備
（一）免疫金的特性
膠體金可以和蛋白質(zhì)等各種大分子物質(zhì)結(jié)合，在免疫組織化學(xué)技術(shù)中，習(xí)慣上將膠體金結(jié)合蛋白質(zhì)的復(fù)合物稱為金探針。用于免疫測(cè)定時(shí)膠體金多與免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體）結(jié)合，這類膠體金結(jié)合物常稱為免疫金復(fù)合物，或簡(jiǎn)稱免疫金（immunogold）。
膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合的機(jī)制尚有十分清楚，一般認(rèn)為是物理吸附性的。膠體金顆粒帶有一層表面陰性電荷，與蛋白質(zhì)表面的陽(yáng)性電荷通過(guò)靜電感應(yīng)相附。因此環(huán)境pH和離子強(qiáng)度是影響吸附的主要因素，其他如膠體金顆粒的大小、蛋白質(zhì)的分子量及蛋白質(zhì)濃度等也會(huì)影響蛋白質(zhì)的吸附。
（二）免疫金的制備
1．用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至選定值。原則上可選擇待標(biāo)記蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，也可略為偏堿。但通常zui適反應(yīng)pH往往需經(jīng)多次試驗(yàn)才能確定。在調(diào)節(jié)膠體金的pH值時(shí)應(yīng)注意，膠體金會(huì)阻塞pH計(jì)的電極，不可直接將電極插入膠體金溶液中，宜先用終濃度為0.15的聚乙二醇（PEG，20000）穩(wěn)定膠體金后，再膠體金的pH值。
2．將1/10體積的合適濃度的蛋白質(zhì)溶液加于膠體金溶液中，放置室溫反應(yīng)2～5min。由于鹽類成分能影響膠體金對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，并可使膠體金聚沉，因此待標(biāo)記蛋白質(zhì)溶液若含有較高的離子濃度，應(yīng)在標(biāo)記前先對(duì)低離子強(qiáng)度的蒸餾水透析去鹽。
3．加入濃度為0.2％的PEG或BSA以飽和游離的膠體金。
4．離心分離，去除上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。離心條件視膠體金顆粒的粒徑而異：對(duì)5nm金顆?？蛇x用40000r/min離心1h；8nm金顆粒用25000r/min離心45min；14nm金顆粒用25000r/min離心30min，40nm金顆粒用15000r/min離心30min。
5．輕吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的緩沖液懸浮，恢復(fù)原體積后再離心。如此洗滌2～4次。以*除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。
6．免疫金復(fù)合物zui終用稀釋液配制成工作濃度保存。稀釋液通常是加入穩(wěn)定劑的緩沖液。緩沖溶液常用中性的PBS或Tris緩沖液。
多種蛋白質(zhì)、葡聚糖、PEG2000、明膠等均為良好的高分子穩(wěn)定劑，PEG和BSA是zui常用的穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑有兩大作用：一為保護(hù)膠體金的穩(wěn)定性，使之便于長(zhǎng)期保存；二為防止或減少免疫金復(fù)合物的非特異性吸附反應(yīng)。穩(wěn)定劑的合理選擇是十分重要的，不適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑有時(shí)也會(huì)導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。
第二節(jié)
一、 膠體金
即金的水溶液，它也具有一般溶膠的特性。分散體系的分類：體系就是一定空間范圍內(nèi)作為我們研究對(duì)象的物質(zhì)，某一種或幾種物質(zhì)分散到另一種物質(zhì)中所組成的體系叫做分散體系。被分散相質(zhì)點(diǎn)的大小而改變，因此，按分散相質(zhì)點(diǎn)的大小不同，可將分散體系分為三類。
（一）離子分散體系
指分?jǐn)?shù)散相以小分子或離子狀態(tài)分散著。這種溶液具有高度穩(wěn)定性，無(wú)論放置多久，分散相顆粒都不會(huì)因重力而下沉，不會(huì)從溶液中分離出來(lái)
（二）膠體分散體系
是指分散相顆粒在1～100nm之間的分散體系叫做膠體分散系。膠體溶液外觀透明不渾濁，在普通顯微鏡下看不見(jiàn)它的分散相粒子，不易受重力影響與分散介質(zhì)分離沉降，但其中的溶膠粒子有聚結(jié)變大的傾向，即具有聚結(jié)不穩(wěn)定性。
（三）粗分散體系
分散相顆粒是由許多分子組成，因粒子較大，用肉眼或顯微鏡即可看見(jiàn)，不穩(wěn)定，極易因重力而自動(dòng)沉降，外觀渾濁不透明。
二、膠體金的一般性狀
（一）膠體金的顏色
溶膠的顏色決定于分散相物質(zhì)的顏色、分散相物質(zhì)的散度和入射光線和種類，是散射光還是透射光，粒子越小，分散度越高，則散射光的波長(zhǎng)越短，對(duì)同一種物質(zhì)的水溶膠來(lái)說(shuō)，粒子大小不同，顏色亦不同，膠體金顆粒在5～20nm之間，吸收波長(zhǎng)520nm，呈葡萄酒紅色，20～40•nm之間吸收波長(zhǎng)530nm，液體為深紅色，60nm的金溶液主要吸收波長(zhǎng)600nm，金溶液呈蘭紫色，若離心去掉較大的金顆粒，溶膠呈紅色。
（二）膠體金的穩(wěn)定性
溶膠的穩(wěn)定性介于小分子離子溶液和粗分散系之間，溶膠的顆粒作布朗運(yùn)動(dòng)，不易受重力影響下沉。然而溶膠又是不穩(wěn)定體系，它的膠粒溶劑化作用很弱，總表面積較大，當(dāng)膠粒相互碰撞時(shí)，有自動(dòng)合并為較大、較重的顆粒傾向。膠體顆粒變大以致超出膠體范圍而從介質(zhì)中沉淀出來(lái)的現(xiàn)象叫聚沉。影響溶膠穩(wěn)定性的主要原因有三點(diǎn)：①膠粒間的相互吸引力。當(dāng)膠粒相距很近時(shí)，這種吸引力可能導(dǎo)致膠粒合并變大。②膠粒及其溶劑化層（溶劑是水就是水化層）的帶電情況。一種溶膠的各個(gè)膠粒都帶有相同的電荷。同性電荷相斥，雙電層愈厚，膠粒帶電量愈大，排斥力愈大，愈能阻止膠粒合并聚結(jié)，溶膠愈穩(wěn)定。③膠體界面的溶劑膜，當(dāng)二固體間夾有一厚層液體時(shí)，這層液體膜有一個(gè)反抗二固體接近的排斥力。兩個(gè)膠粒要進(jìn)一步接近，只有克服它們之間的溶劑化膜的斥力才有可能，因此溶劑膜的斥力是使溶膠穩(wěn)定的原因之一。
（三）溶膠的聚沉現(xiàn)象
膠粒之間存在吸引力與排斥力這對(duì)矛盾，在溶膠顆粒帶電及溶劑化的情況下，排斥力成為矛盾的主要方面，溶膠穩(wěn)定而不聚沉。因?yàn)槟撤N原因使溶膠顆粒帶電量減到很小甚至中和；其所帶電荷并能去溶劑化膜，膠粒之間可在更近的距離互相接近，引力成為主要矛盾，引力超過(guò)斥力時(shí)膠粒便聚結(jié)發(fā)生聚沉。引起溶膠聚沉的原因有：
1．少量電介質(zhì)對(duì)溶膠的聚沉作用 少量電介質(zhì)即可使溶膠聚沉，但各種電介質(zhì)的聚沉能力可用聚沉值來(lái)表示，聚沉值愈小，聚沉能力愈大，聚沉值從實(shí)驗(yàn)中得出如下的離子價(jià)規(guī)則：①電介質(zhì)負(fù)離子對(duì)帶正電的溶膠起主要聚沉作用，正離子對(duì)帶負(fù)電的溶膠起主要聚沉作用。②同價(jià)離子聚沉能力幾乎相等，不同價(jià)離子的聚沉能力隨離子價(jià)的增加而顯著增加。電介質(zhì)為什么能使溶膠聚沉呢？這是由于電介質(zhì)與膠粒帶相反電荷的離子的作用，中和了膠粒所帶的一部分電荷，使膠粒電荷量減少，擴(kuò)散層縮小，溶劑化層變薄，而當(dāng)雙電層厚度縮至很小的溶劑化層變得很薄時(shí)，兩個(gè)膠粒間便可以更加接近即不產(chǎn)生斥力，兩個(gè)膠粒間因引力加大而合并的趨勢(shì)增強(qiáng)，甚至引力占優(yōu)勢(shì)以致使膠粒聚結(jié)而發(fā)生聚沉。膠粒的雙電層結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5
2．溫度對(duì)溶膠穩(wěn)定性的影響一般影響不大，當(dāng)溫度升高時(shí)，吸附能力減弱，溶劑化程度降低，溶劑化層變薄，膠粒聚結(jié)，不穩(wěn)定性增加。
3．濃度對(duì)溶膠的穩(wěn)定性的影響濃度增大時(shí)，粒子間距離縮小，引力增加，容易聚結(jié)而發(fā)生聚沉，所以制備比較穩(wěn)定的溶膠，要有一定的合適濃度。
*節(jié)免疫膠體金的制備
一、膠體金的特性和制備
（一）膠體金的結(jié)構(gòu)
膠體金（colloidalgold）也稱金溶膠（goldsol），是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子（AuC12－），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。膠體金顆粒的基礎(chǔ)金核并非是理想的圓球核，較小的膠體金顆?；臼菆A球形的，較大的膠體金顆粒（一般指大于30nm以上的）多呈橢圓形。在電子顯微鏡下可觀察膠體金的顆粒形態(tài)。
（二）膠體金的特性
1．膠體性質(zhì)膠體金顆粒大小多在1～100nm，微小金顆粒穩(wěn)定地、均勻地、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中，成為膠體金溶液。膠體金因而具有膠體的多種特性，特別是對(duì)電解質(zhì)的敏感性。電解質(zhì)能破壞膠體金顆粒的外周永水化層，從而打破膠體的穩(wěn)定狀態(tài)，使分散的單一金顆粒凝聚成大顆粒，而從液體中沉淀下來(lái)。某些蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)有保護(hù)膠體金、加強(qiáng)其穩(wěn)定性的作用。
2．呈色性微小顆粒膠體呈紅色，但不同大小的膠體呈色有一定的差別。zui小的膠體金（2～5nm）是橙黃色的，中等大小的膠體金（10～20nm）是酒紅色的，較大顆粒的膠體金（30～80nm）則是紫紅色的。根據(jù)這一特點(diǎn)，用肉眼觀察膠體金的顏色可粗略估計(jì)金顆粒的大小。
3．光吸收性膠體金在可見(jiàn)光范圍內(nèi)有一單一光吸收峰，這個(gè)光吸收峰的波長(zhǎng)（λmax）在510～550nm范圍內(nèi)，隨膠體金顆粒大小而變化，大顆粒膠體金的λmax偏向長(zhǎng)波長(zhǎng)，反之，小顆粒膠體金的λmax則偏于短波長(zhǎng)，表19-1所列為部分膠體金的λmax。
（三）膠體金的制備
1．制備方法膠體金的制備多采用還原法。氯金酸（HauC14）是主要還原材料，常用還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。根據(jù)還原劑類型以及還原作用的強(qiáng)弱，可以制備0.8nm～150nm不等的膠體金。zui常用的制備方法為檸檬酸鹽還原法。具體操作方法如下：
（1）將HauC14先配制成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸。
（2）攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入一定量的1％檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7•2H2O）水溶液。
（3）繼續(xù)加熱煮沸15min。此時(shí)可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過(guò)程約2～3min。
（4）冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積。
用此法可制備16～147nm粒徑的膠體金。金顆粒的大小取決于制備時(shí)加入的檸檬酸三鈉的量。表19-1列舉制備4種不同粒徑膠體金時(shí)檸檬酸三鈉的用量。
表19-1 四種粒徑膠體金的制備及特性
膠體金粒徑（nm） 1％檸檬酸三鈉加入量（ml）*膠體金特性
呈色 λmax
16 2.00 橙色 518nm
24.5 1.50 橙紅 522nm
41 1.00 紅色 525nm
71.5 0.70 紫色 535nm
*還原100ml0.01％HauC14所需量
2．注意事項(xiàng)
（1）氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。
（2）氯金酸對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，因此在配制氯金酸水溶液時(shí)，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。
（3）用于制備膠體金的蒸餾水應(yīng)是雙蒸餾水或三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水。
（4）是以制備膠體金的玻璃容器必須是清潔的，用前應(yīng)先經(jīng)酸洗并用蒸餾水沖凈。是經(jīng)硅化處理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數(shù)分鐘，用蒸餾水沖凈后干燥備用。
（5）膠體金的鑒定和保存：膠體金的制備并不難，但要制好高質(zhì)量的膠體金卻也并非易事。因此對(duì)每次制好的膠體金應(yīng)加以檢定，主要檢查指標(biāo)有顆粒大小，粒徑的均一程度及有無(wú)凝集顆粒等。
肉眼觀察是zui基本也是zui簡(jiǎn)單和方便的檢定方法，但需要一定的經(jīng)驗(yàn)。良好的膠體金應(yīng)該是清亮透明的，若制備的膠體金混濁或液體表面有漂浮物，提示此次制備的膠體金有較多的凝集顆粒。在日光下仔細(xì)觀察比較膠體金的顏色，可以粗略估計(jì)制得的金顆粒的大小。當(dāng)然也可用分光光度計(jì)掃描λmax來(lái)估計(jì)金顆粒的粒徑。結(jié)制備的膠體金作電鏡觀察，并選一些代表性的作顯微攝影，可以比較地測(cè)定膠體金的平均粒徑。
膠體金在潔凈的玻璃器皿中可較長(zhǎng)時(shí)間保存，加入少許防腐劑（如0.02％NaN3）可有利于保存。保存不當(dāng)時(shí)會(huì)有細(xì)菌生長(zhǎng)或有凝集顆粒形成。少量凝集顆粒并不影響以后膠體金的標(biāo)記，使用時(shí)為提高標(biāo)記效率可先低速離心去除凝集顆粒。
二、免疫金的特性和制備
（一）免疫金的特性
膠體金可以和蛋白質(zhì)等各種大分子物質(zhì)結(jié)合，在免疫組織化學(xué)技術(shù)中，習(xí)慣上將膠體金結(jié)合蛋白質(zhì)的復(fù)合物稱為金探針。用于免疫測(cè)定時(shí)膠體金多與免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體）結(jié)合，這類膠體金結(jié)合物常稱為免疫金復(fù)合物，或簡(jiǎn)稱免疫金（immunogold）。
膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合的機(jī)制尚有十分清楚，一般認(rèn)為是物理吸附性的。膠體金顆粒帶有一層表面陰性電荷，與蛋白質(zhì)表面的陽(yáng)性電荷通過(guò)靜電感應(yīng)相附。因此環(huán)境pH和離子強(qiáng)度是影響吸附的主要因素，其他如膠體金顆粒的大小、蛋白質(zhì)的分子量及蛋白質(zhì)濃度等也會(huì)影響蛋白質(zhì)的吸附。
（二）免疫金的制備
1．用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至選定值。原則上可選擇待標(biāo)記蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，也可略為偏堿。但通常zui適反應(yīng)pH往往需經(jīng)多次試驗(yàn)才能確定。在調(diào)節(jié)膠體金的pH值時(shí)應(yīng)注意，膠體金會(huì)阻塞pH計(jì)的電極，不可直接將電極插入膠體金溶液中，宜先用終濃度為0.15的聚乙二醇（PEG，20000）穩(wěn)定膠體金后，再膠體金的pH值。
2．將1/10體積的合適濃度的蛋白質(zhì)溶液加于膠體金溶液中，放置室溫反應(yīng)2～5min。由于鹽類成分能影響膠體金對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，并可使膠體金聚沉，因此待標(biāo)記蛋白質(zhì)溶液若含有較高的離子濃度，應(yīng)在標(biāo)記前先對(duì)低離子強(qiáng)度的蒸餾水透析去鹽。
3．加入濃度為0.2％的PEG或BSA以飽和游離的膠體金。
4．離心分離，去除上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。離心條件視膠體金顆粒的粒徑而異：對(duì)5nm金顆?？蛇x用40000r/min離心1h；8nm金顆粒用25000r/min離心45min；14nm金顆粒用25000r/min離心30min，40nm金顆粒用15000r/min離心30min。
5．輕吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的緩沖液懸浮，恢復(fù)原體積后再離心。如此洗滌2～4次。以*除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。
6．免疫金復(fù)合物zui終用稀釋液配制成工作濃度保存。稀釋液通常是加入穩(wěn)定劑的緩沖液。緩沖溶液常用中性的PBS或Tris緩沖液。
多種蛋白質(zhì)、葡聚糖、PEG2000、明膠等均為良好的高分子穩(wěn)定劑，PEG和BSA是zui常用的穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑有兩大作用：一為保護(hù)膠體金的穩(wěn)定性，使之便于長(zhǎng)期保存；二為防止或減少免疫金復(fù)合物的非特異性吸附反應(yīng)。穩(wěn)定劑的合理選擇是十分重要的，不適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑有時(shí)也會(huì)導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。
第二節(jié)
一、 膠體金
即金的水溶液，它也具有一般溶膠的特性。分散體系的分類：體系就是一定空間范圍內(nèi)作為我們研究對(duì)象的物質(zhì)，某一種或幾種物質(zhì)分散到另一種物質(zhì)中所組成的體系叫做分散體系。被分散相質(zhì)點(diǎn)的大小而改變，因此，按分散相質(zhì)點(diǎn)的大小不同，可將分散體系分為三類。
（一）離子分散體系
指分?jǐn)?shù)散相以小分子或離子狀態(tài)分散著。這種溶液具有高度穩(wěn)定性，無(wú)論放置多久，分散相顆粒都不會(huì)因重力而下沉，不會(huì)從溶液中分離出來(lái)
（二）膠體分散體系
是指分散相顆粒在1～100nm之間的分散體系叫做膠體分散系。膠體溶液外觀透明不渾濁，在普通顯微鏡下看不見(jiàn)它的分散相粒子，不易受重力影響與分散介質(zhì)分離沉降，但其中的溶膠粒子有聚結(jié)變大的傾向，即具有聚結(jié)不穩(wěn)定性。
（三）粗分散體系
分散相顆粒是由許多分子組成，因粒子較大，用肉眼或顯微鏡即可看見(jiàn)，不穩(wěn)定，極易因重力而自動(dòng)沉降，外觀渾濁不透明。
二、膠體金的一般性狀
（一）膠體金的顏色
溶膠的顏色決定于分散相物質(zhì)的顏色、分散相物質(zhì)的散度和入射光線和種類，是散射光還是透射光，粒子越小，分散度越高，則散射光的波長(zhǎng)越短，對(duì)同一種物質(zhì)的水溶膠來(lái)說(shuō)，粒子大小不同，顏色亦不同，膠體金顆粒在5～20nm之間，吸收波長(zhǎng)520nm，呈葡萄酒紅色，20～40•nm之間吸收波長(zhǎng)530nm，液體為深紅色，60nm的金溶液主要吸收波長(zhǎng)600nm，金溶液呈蘭紫色，若離心去掉較大的金顆粒，溶膠呈紅色。
（二）膠體金的穩(wěn)定性
溶膠的穩(wěn)定性介于小分子離子溶液和粗分散系之間，溶膠的顆粒作布朗運(yùn)動(dòng)，不易受重力影響下沉。然而溶膠又是不穩(wěn)定體系，它的膠粒溶劑化作用很弱，總表面積較大，當(dāng)膠粒相互碰撞時(shí)，有自動(dòng)合并為較大、較重的顆粒傾向。膠體顆粒變大以致超出膠體范圍而從介質(zhì)中沉淀出來(lái)的現(xiàn)象叫聚沉。影響溶膠穩(wěn)定性的主要原因有三點(diǎn)：①膠粒間的相互吸引力。當(dāng)膠粒相距很近時(shí)，這種吸引力可能導(dǎo)致膠粒合并變大。②膠粒及其溶劑化層（溶劑是水就是水化層）的帶電情況。一種溶膠的各個(gè)膠粒都帶有相同的電荷。同性電荷相斥，雙電層愈厚，膠粒帶電量愈大，排斥力愈大，愈能阻止膠粒合并聚結(jié)，溶膠愈穩(wěn)定。③膠體界面的溶劑膜，當(dāng)二固體間夾有一厚層液體時(shí)，這層液體膜有一個(gè)反抗二固體接近的排斥力。兩個(gè)膠粒要進(jìn)一步接近，只有克服它們之間的溶劑化膜的斥力才有可能，因此溶劑膜的斥力是使溶膠穩(wěn)定的原因之一。
（三）溶膠的聚沉現(xiàn)象
膠粒之間存在吸引力與排斥力這對(duì)矛盾，在溶膠顆粒帶電及溶劑化的情況下，排斥力成為矛盾的主要方面，溶膠穩(wěn)定而不聚沉。因?yàn)槟撤N原因使溶膠顆粒帶電量減到很小甚至中和；其所帶電荷并能去溶劑化膜，膠粒之間可在更近的距離互相接近，引力成為主要矛盾，引力超過(guò)斥力時(shí)膠粒便聚結(jié)發(fā)生聚沉。引起溶膠聚沉的原因有：
1．少量電介質(zhì)對(duì)溶膠的聚沉作用 少量電介質(zhì)即可使溶膠聚沉，但各種電介質(zhì)的聚沉能力可用聚沉值來(lái)表示，聚沉值愈小，聚沉能力愈大，聚沉值從實(shí)驗(yàn)中得出如下的離子價(jià)規(guī)則：①電介質(zhì)負(fù)離子對(duì)帶正電的溶膠起主要聚沉作用，正離子對(duì)帶負(fù)電的溶膠起主要聚沉作用。②同價(jià)離子聚沉能力幾乎相等，不同價(jià)離子的聚沉能力隨離子價(jià)的增加而顯著增加。電介質(zhì)為什么能使溶膠聚沉呢？這是由于電介質(zhì)與膠粒帶相反電荷的離子的作用，中和了膠粒所帶的一部分電荷，使膠粒電荷量減少，擴(kuò)散層縮小，溶劑化層變薄，而當(dāng)雙電層厚度縮至很小的溶劑化層變得很薄時(shí)，兩個(gè)膠粒間便可以更加接近即不產(chǎn)生斥力，兩個(gè)膠粒間因引力加大而合并的趨勢(shì)增強(qiáng)，甚至引力占優(yōu)勢(shì)以致使膠粒聚結(jié)而發(fā)生聚沉。膠粒的雙電層結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5
2．溫度對(duì)溶膠穩(wěn)定性的影響一般影響不大，當(dāng)溫度升高時(shí)，吸附能力減弱，溶劑化程度降低，溶劑化層變薄，膠粒聚結(jié)，不穩(wěn)定性增加。
3．濃度對(duì)溶膠的穩(wěn)定性的影響濃度增大時(shí)，粒子間距離縮小，引力增加，容易聚結(jié)而發(fā)生聚沉，所以制備比較穩(wěn)定的溶膠，要有一定的合適濃度。
第三節(jié)膠體金的制備技術(shù)
膠體金溶液的制備有許多種方法，其中zui常用的是化學(xué)還原法，基本的原理是向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子變成金原子。目前常用的還原劑有：白磷、乙醇、過(guò)氧化氫、硼氫化鈉、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等，下面分別介紹制備不同大小顆粒的膠體金溶液。
一、制備膠體金的
（一）玻璃器皿的清潔
制備膠體金的成功與失敗除試劑因素以外玻璃器皿清潔是非常關(guān)鍵的一步。如果玻璃器皿內(nèi)不干凈或者有灰塵落入就會(huì)干擾膠體金顆粒的生成，形成的顆粒大小不一，顏色微紅、無(wú)色或混濁不透明。我們的經(jīng)驗(yàn)是制備膠體金的所有玻璃器皿先用自來(lái)水把玻璃器皿上的灰塵流水沖洗干凈，加入清潔液（重鉻酸鉀1000g,加入濃硫酸2500ml，加蒸餾水至10000ml）浸泡24h，自來(lái)水洗凈清潔液，然后每個(gè)玻璃器皿用洗潔劑洗3～4次，自來(lái)水沖洗掉洗潔劑，用蒸餾水洗3～4次，再用雙蒸水把每個(gè)器皿洗3～4次，烤箱干燥后備用。通過(guò)此方法的處理玻璃器皿不需要硅化處理，而直接制備膠體金。也可用已經(jīng)制備的膠體金溶液，用同等大不顆粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后棄去，再用雙蒸水洗凈，即可使用，這樣效果更好，因?yàn)闇p少了金顆粒的吸附作用。
（二）試劑的配制要求
（1）所有配制試劑的容器均按以上要求酸處理洗凈，配制試劑用雙蒸餾水或三蒸餾水。
（2）氯化金（HauCl4水溶液的配制：將lg的氯化金一次溶解于雙蒸水中配成1%的水溶液。放在4”c冰箱內(nèi)保存長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月至1年左右，仍保持穩(wěn)定。
（3）白磷或黃磷乙----溶液的配制：白磷在空氣中易燃燒，要格外小心操作。把白磷在雙蒸水中切成小塊，放在濾紙上吸于水份后，迅速放入已準(zhǔn)備好的乙------中去，輕輕搖動(dòng)，等*溶解后即得飽和溶液。儲(chǔ)藏于棕色密閉瓶?jī)?nèi)，放在陰涼處保存。
二、制備膠體金的方法和步驟
（一）白磷還原法
1．白磷還原法（Z Sigmondy 1905年）
（1）取1%的HAuCl4水溶液1ml，加雙蒸水99ml配成0.01%的HAuCl4水溶液。
（2）用0.2mol/L K2CO3調(diào)pH至7.2。
（3）加熱煮沸騰，迅速加入0.5ml
20%白磷的飽和乙------溶液，振蕩數(shù)分鐘至溶液呈現(xiàn)橙紅色時(shí)即成。膠體金的顆粒直徑為3nm左右，大小較均勻。
2．白磷還原法（Z Sigmondy 1905及Z Sigmondy Thiessen 1925）
（1）取0.6%的HAuCl4水溶液2.5ml,加雙蒸水120ml 。
（2）用0.2mol/L K2CO3,調(diào)pH至中性。
（3）加入1/5飽和度的白磷乙------溶液1ml（1份白磷4份乙------），在室溫振蕩約15min，溶液呈紅褐色，再加熱至典型的葡萄酒紅色，加熱可使乙------蒸發(fā)，膠體金液體內(nèi)過(guò)量的白磷通入空氣后被氧化，此方法獲得膠體金顆粒的直徑在5～12nm之間。
3．白磷還原法的改良法（Henegouwen 1986）
（1）取20%飽和度白磷乙------溶液0.5ml,加雙蒸水60ml 。
（2）用1%的HAuCl4水溶液0.75ml, 加0.1mol/L K2CO30.6ml, 振蕩變成棕紅色。
（3）加熱煮沸，至溶液變成透明紅色。
使用上述方法增加還原次數(shù)使金顆粒直徑不斷增大，二者之間的關(guān)系見(jiàn)表5-1。
表5-1 膠體金顆粒大小與還原次數(shù)之間的關(guān)系
還原次數(shù)顆粒直徑（nm）正負(fù)誤差
15.60.9
26.70.9
37.90.9
49.81.3
5121.0
此方法主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)化了制備不同大小的顆粒膠體金的手續(xù)和其它試劑的配制,經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)單。另外，在多次還原過(guò)程中氯化金不再形成新的金顆粒，只是在原先金粒子基礎(chǔ)上使它的直徑變大。*次金顆粒起著“晶核”的作用。由于這一特點(diǎn)，制備的金顆粒相對(duì)均勻一致。
（二）抗體血酸還原法（Stathis and Fabrikanos 1958）
（1）將在4℃預(yù)冷的1%HAuCl4水溶液1ml,0.2mol/L K2CO31.5ml、雙蒸水25ml混勻。
（2）在攪拌下加入1ml 0.7%抗壞血酸水溶液，立即呈現(xiàn)紫紅色。
（3）加雙蒸水至100ml，加熱至溶液變?yōu)橥该骷t色為止。膠體金顆粒直徑為8～13nm。
（三）檸檬酸三鈉還原法（Frens 1973）
此方法是由Frens在1973年創(chuàng)立的，制備程序很簡(jiǎn)單，膠體金的顆粒大小較一致，廣為采用。該法一般先將0.01%的HAuCl4溶液加熱至沸騰，迅速加入一定量1%檸檬酸三鈉水溶液，開(kāi)始有些藍(lán)色，然后淺藍(lán)、藍(lán)色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸7～10min出現(xiàn)透明的橙紅色。各種顆粒的膠體金制備詳見(jiàn)表5-2。
表5-2 檸檬酸三鈉用量與膠體金顆粒直徑的關(guān)系
0.01%的HAuCl4（ml）1%檸檬酸三鈉（ml）直徑（ml）
1005.010.0
1004.015.0
1001.525.0
1001.050.0
1000.7560.0
1000.6070.0
1000.4298.0
1000.32147.0
1000.25160
按照Frens法還可以制備出其它不同顆粒大小的膠體金出來(lái)。許多研究證明用該法制備膠體金時(shí)金顆粒的大小是檸檬酸三鈉用量的函數(shù)，基本的規(guī)律是檸檬酸三鈉用量多，膠體金顆粒直徑小，檸檬酸三鈉用量越少，腔體金顆粒直徑越大。
（四）鞣酸?檸檬酸三鈉還原法（Slot與Gueeze1985年）
該法是以1982年Muhlpfordt法為基礎(chǔ)，1985年Slot與Geuze對(duì)該法進(jìn)行了改良，特點(diǎn)是通過(guò)改變鞣酸的用量制備出多種顆粒直徑的膠體金，而且顆粒的直徑均勻一致，很適合于雙標(biāo)及多標(biāo)研究。制備3nm、5nm、10nm、15nm的膠體金顆粒見(jiàn)表5-3。
表5-3 鞣酸?檸檬酸三鈉還原法
A 液B 液
直徑（nm）1%檸檬酸鈉（ml）0.1mol/L
K2CO3ml1%鞣酸（ml）H2O（ml）1%HAuCl4（ml）H2O（ml）
3.340.2411.8179
540.20.715.1179
1040.0250.115.875179
1540.00250.0115.987179
操作步驟：
（1）根據(jù)所需要的膠體金顆粒分別配制A液和B液。
（2）將配制好的A、B兩液在水浴內(nèi)加熱到60℃，并通過(guò)控溫裝置使溫度保持穩(wěn)定。
（3）在電磁攪拌器上攪拌A液迅速加入B液，繼續(xù)加熱直至膠體金變成葡萄酒色，時(shí)間大約7～10min。在A、B兩液混合后可見(jiàn)溶液立即變成藍(lán)色，大約1～3 min就變成紅色。
用鞣酸?檸檬酸三鈉還原法，檸檬酸三鈉主要為還原劑，而鞣酸則有雙重作用，一是還原作用，二是保護(hù)作用，控制“晶核”的形成過(guò)程，也就是說(shuō)鞣酸的用量多少?zèng)Q定膠體金顆粒的大小形成，因此改變鞣酸的用量就可以改變膠體金的顆粒大小，達(dá)到制備不同直徑顆粒的膠體金之目的。
（五）乙醇超聲波還原法（Baigent and Muller 1980）
（1）1%HAuCl4水溶濃0.2ml加入100ml雙蒸水。
（2）用0.2molK2CO3調(diào)pH至中性，再加入1ml乙醇。
（3）用20KC、125w超聲波探頭浸入溶液內(nèi)進(jìn)行超聲振蕩，由此法制得的膠體金顆粒為6～10nm。
（六）硼氫化鈉還原法（Tschopp et al 1982）
（1）將預(yù)冷在4℃的40ml雙蒸水中加入0.6ml 1%的HAuCl4。
（2）再加入0.2molK2CO3，0.2ml。
（3）在攪拌下，迅速加入新鮮配制的硼氫化鈉水溶液（0.5mg/ml）0.4ml,一般重復(fù)加入3～5次，直至溶液的蘭紫色變?yōu)槌燃t色為至。然后再攪拌5min，獲得的金顆粒直徑在2～5nm之間。
（七）放射性膠體金的制備方法（Kent and Allen 1981）
（1）取0.01% HAuCl4 上水溶液100ml，加熱至沸騰。
（2）加入40μl19u。
（3）迅速加入4ml1% 檸檬酸三鈉水溶液，5～7min出現(xiàn)透明的橙紅色。
（4）其含量為I×106脈沖數(shù)/min。
（八）微波制備液體金方法。
膠體金溶液的制備有許多種方法，其中zui常用的是化學(xué)還原法，基本的原理是向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子變成金原子。目前常用的還原劑有：白磷、乙醇、過(guò)氧化氫、硼氫化鈉、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等，下面分別介紹制備不同大小顆粒的膠體金溶液。
一、制備膠體金的
（一）玻璃器皿的清潔
制備膠體金的成功與失敗除試劑因素以外玻璃器皿清潔是非常關(guān)鍵的一步。如果玻璃器皿內(nèi)不干凈或者有灰塵落入就會(huì)干擾膠體金顆粒的生成，形成的顆粒大小不一，顏色微紅、無(wú)色或混濁不透明。我們的經(jīng)驗(yàn)是制備膠體金的所有玻璃器皿先用自來(lái)水把玻璃器皿上的灰塵流水沖洗干凈，加入清潔液（重鉻酸鉀1000g,加入濃硫酸2500ml，加蒸餾水至10000ml）浸泡24h，自來(lái)水洗凈清潔液，然后每個(gè)玻璃器皿用洗潔劑洗3～4次，自來(lái)水沖洗掉洗潔劑，用蒸餾水洗3～4次，再用雙蒸水把每個(gè)器皿洗3～4次，烤箱干燥后備用。通過(guò)此方法的處理玻璃器皿不需要硅化處理，而直接制備膠體金。也可用已經(jīng)制備的膠體金溶液，用同等大不顆粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后棄去，再用雙蒸水洗凈，即可使用，這樣效果更好，因?yàn)闇p少了金顆粒的吸附作用。
（二）試劑的配制要求
（1）所有配制試劑的容器均按以上要求酸處理洗凈，配制試劑用雙蒸餾水或三蒸餾水。
（2）氯化金（HauCl4水溶液的配制：將lg的氯化金一次溶解于雙蒸水中配成1%的水溶液。放在4”c冰箱內(nèi)保存長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月至1年左右，仍保持穩(wěn)定。
（3）白磷或黃磷乙----溶液的配制：白磷在空氣中易燃燒，要格外小心操作。把白磷在雙蒸水中切成小塊，放在濾紙上吸于水份后，迅速放入已準(zhǔn)備好的乙------中去，輕輕搖動(dòng)，等*溶解后即得飽和溶液。儲(chǔ)藏于棕色密閉瓶?jī)?nèi)，放在陰涼處保存。
二、制備膠體金的方法和步驟
（一）白磷還原法
1．白磷還原法（Z Sigmondy 1905年）
（1）取1%的HAuCl4水溶液1ml，加雙蒸水99ml配成0.01%的HAuCl4水溶液。
（2）用0.2mol/L K2CO3調(diào)pH至7.2。
（3）加熱煮沸騰，迅速加入0.5ml
20%白磷的飽和乙------溶液，振蕩數(shù)分鐘至溶液呈現(xiàn)橙紅色時(shí)即成。膠體金的顆粒直徑為3nm左右，大小較均勻。
2．白磷還原法（Z Sigmondy 1905及Z Sigmondy Thiessen 1925）
（1）取0.6%的HAuCl4水溶液2.5ml,加雙蒸水120ml 。
（2）用0.2mol/L K2CO3,調(diào)pH至中性。
（3）加入1/5飽和度的白磷乙------溶液1ml（1份白磷4份乙------），在室溫振蕩約15min，溶液呈紅褐色，再加熱至典型的葡萄酒紅色，加熱可使乙------蒸發(fā)，膠體金液體內(nèi)過(guò)量的白磷通入空氣后被氧化，此方法獲得膠體金顆粒的直徑在5～12nm之間。
3．白磷還原法的改良法（Henegouwen 1986）
（1）取20%飽和度白磷乙------溶液0.5ml,加雙蒸水60ml 。
（2）用1%的HAuCl4水溶液0.75ml, 加0.1mol/L K2CO30.6ml, 振蕩變成棕紅色。
（3）加熱煮沸，至溶液變成透明紅色。
使用上述方法增加還原次數(shù)使金顆粒直徑不斷增大，二者之間的關(guān)系見(jiàn)表5-1。
表5-1 膠體金顆粒大小與還原次數(shù)之間的關(guān)系
還原次數(shù)顆粒直徑（nm）正負(fù)誤差
15.60.9
26.70.9
37.90.9
49.81.3
5121.0
此方法主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)化了制備不同大小的顆粒膠體金的手續(xù)和其它試劑的配制,經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)單。另外，在多次還原過(guò)程中氯化金不再形成新的金顆粒，只是在原先金粒子基礎(chǔ)上使它的直徑變大。*次金顆粒起著“晶核”的作用。由于這一特點(diǎn)，制備的金顆粒相對(duì)均勻一致。
（二）抗體血酸還原法（Stathis and Fabrikanos 1958）
（1）將在4℃預(yù)冷的1%HAuCl4水溶液1ml,0.2mol/L K2CO31.5ml、雙蒸水25ml混勻。
（2）在攪拌下加入1ml 0.7%抗壞血酸水溶液，立即呈現(xiàn)紫紅色。
（3）加雙蒸水至100ml，加熱至溶液變?yōu)橥该骷t色為止。膠體金顆粒直徑為8～13nm。
（三）檸檬酸三鈉還原法（Frens 1973）
此方法是由Frens在1973年創(chuàng)立的，制備程序很簡(jiǎn)單，膠體金的顆粒大小較一致，廣為采用。該法一般先將0.01%的HAuCl4溶液加熱至沸騰，迅速加入一定量1%檸檬酸三鈉水溶液，開(kāi)始有些藍(lán)色，然后淺藍(lán)、藍(lán)色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸7～10min出現(xiàn)透明的橙紅色。各種顆粒的膠體金制備詳見(jiàn)表5-2。
表5-2 檸檬酸三鈉用量與膠體金顆粒直徑的關(guān)系
0.01%的HAuCl4（ml）1%檸檬酸三鈉（ml）直徑（ml）
1005.010.0
1004.015.0
1001.525.0
1001.050.0
1000.7560.0
1000.6070.0
1000.4298.0
1000.32147.0
1000.25160
按照Frens法還可以制備出其它不同顆粒大小的膠體金出來(lái)。許多研究證明用該法制備膠體金時(shí)金顆粒的大小是檸檬酸三鈉用量的函數(shù)，基本的規(guī)律是檸檬酸三鈉用量多，膠體金顆粒直徑小，檸檬酸三鈉用量越少，腔體金顆粒直徑越大。
（四）鞣酸?檸檬酸三鈉還原法（Slot與Gueeze1985年）
該法是以1982年Muhlpfordt法為基礎(chǔ)，1985年Slot與Geuze對(duì)該法進(jìn)行了改良，特點(diǎn)是通過(guò)改變鞣酸的用量制備出多種顆粒直徑的膠體金，而且顆粒的直徑均勻一致，很適合于雙標(biāo)及多標(biāo)研究。制備3nm、5nm、10nm、15nm的膠體金顆粒見(jiàn)表5-3。
表5-3 鞣酸?檸檬酸三鈉還原法
A 液B 液
直徑（nm）1%檸檬酸鈉（ml）0.1mol/L
K2CO3ml1%鞣酸（ml）H2O（ml）1%HAuCl4（ml）H2O（ml）
3.340.2411.8179
540.20.715.1179
1040.0250.115.875179
1540.00250.0115.987179
操作步驟：
（1）根據(jù)所需要的膠體金顆粒分別配制A液和B液。
（2）將配制好的A、B兩液在水浴內(nèi)加熱到60℃，并通過(guò)控溫裝置使溫度保持穩(wěn)定。
（3）在電磁攪拌器上攪拌A液迅速加入B液，繼續(xù)加熱直至膠體金變成葡萄酒色，時(shí)間大約7～10min。在A、B兩液混合后可見(jiàn)溶液立即變成藍(lán)色，大約1～3 min就變成紅色。
用鞣酸?檸檬酸三鈉還原法，檸檬酸三鈉主要為還原劑，而鞣酸則有雙重作用，一是還原作用，二是保護(hù)作用，控制“晶核”的形成過(guò)程，也就是說(shuō)鞣酸的用量多少?zèng)Q定膠體金顆粒的大小形成，因此改變鞣酸的用量就可以改變膠體金的顆粒大小，達(dá)到制備不同直徑顆粒的膠體金之目的。
（五）乙醇超聲波還原法（Baigent and Muller 1980）
（1）1%HAuCl4水溶濃0.2ml加入100ml雙蒸水。
（2）用0.2molK2CO3調(diào)pH至中性，再加入1ml乙醇。
（3）用20KC、125w超聲波探頭浸入溶液內(nèi)進(jìn)行超聲振蕩，由此法制得的膠體金顆粒為6～10nm。
（六）硼氫化鈉還原法（Tschopp et al 1982）
（1）將預(yù)冷在4℃的40ml雙蒸水中加入0.6ml 1%的HAuCl4。
（2）再加入0.2molK2CO3，0.2ml。
（3）在攪拌下，迅速加入新鮮配制的硼氫化鈉水溶液（0.5mg/ml）0.4ml,一般重復(fù)加入3～5次，直至溶液的蘭紫色變?yōu)槌燃t色為至。然后再攪拌5min，獲得的金顆粒直徑在2～5nm之間。
（七）放射性膠體金的制備方法（Kent and Allen 1981）
（1）取0.01% HAuCl4 上水溶液100ml，加熱至沸騰。
（2）加入40μl19u。
（3）迅速加入4ml1% 檸檬酸三鈉水溶液，5～7min出現(xiàn)透明的橙紅色。
（4）其含量為I×106脈沖數(shù)/min。
（八）微波制備液體金方法。
第四節(jié)膠體金的質(zhì)量鑒定
膠體金制備完畢后須經(jīng)電鏡下質(zhì)量鑒定才能應(yīng)用
一、膠體金顆粒直徑測(cè)定
用預(yù)先處理好的覆有Formvar膜的鎳網(wǎng)浸入膠體金溶液內(nèi)，取現(xiàn)放在空氣中干燥或37℃烤箱烤干。然后在透射電鏡下觀察，主要觀察金顆粒的大小，符合不符合所需要的顆粒直徑，金顆粒是否均勻一致，有無(wú)橢圓形及多角形金顆粒存在。理想的金顆粒是大小基本相等，均勻一致，無(wú)橢圓形及多角形的金顆粒存在，還可以拍片放大后測(cè)量金顆粒直徑的大小。
二、膠體金金顆粒均勻度測(cè)定
一般需測(cè)量100個(gè)以上的膠體金顆粒，然后用統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)算膠體金顆粒的平均直徑及標(biāo)準(zhǔn)差，前者反映顆粒的大小，后者說(shuō)明顆粒是否均勻一致。
三、影響膠體金顆粒大小的因素
如果有較多的大小不等的金顆粒及有橢圓形，三角形金顆粒存在應(yīng)重新制備。一般造成這種情況的主要原因是在加還原劑的時(shí)候不是迅速一次加入，而是多次加入。再者攪拌不均勻，速度太慢沒(méi)有攪拌起來(lái)，造成了顆粒大小不等。制備量的多少，容器的大小，加熱的時(shí)間等也影響膠體金顆粒的大小。制備了合格的膠體金以后，放在室溫或4℃保存。避免低溫凍存，因?yàn)閮龃婵蓪?dǎo)致膠體金凝集，破壞了膠體狀態(tài)。膠體金在室溫避光無(wú)灰塵的環(huán)境中可放置3個(gè)月左右。冰箱內(nèi)半年左右。根據(jù)膠體金的性質(zhì)，有不穩(wěn)定和聚沉的可能性，因此，制備完畢后在20天以內(nèi)進(jìn)行標(biāo)記。
膠體金制備完畢后須經(jīng)電鏡下質(zhì)量鑒定才能應(yīng)用
一、膠體金顆粒直徑測(cè)定
用預(yù)先處理好的覆有Formvar膜的鎳網(wǎng)浸入膠體金溶液內(nèi)，取現(xiàn)放在空氣中干燥或37℃烤箱烤干。然后在透射電鏡下觀察，主要觀察金顆粒的大小，符合不符合所需要的顆粒直徑，金顆粒是否均勻一致，有無(wú)橢圓形及多角形金顆粒存在。理想的金顆粒是大小基本相等，均勻一致，無(wú)橢圓形及多角形的金顆粒存在，還可以拍片放大后測(cè)量金顆粒直徑的大小。
二、膠體金金顆粒均勻度測(cè)定
一般需測(cè)量100個(gè)以上的膠體金顆粒，然后用統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)算膠體金顆粒的平均直徑及標(biāo)準(zhǔn)差，前者反映顆粒的大小，后者說(shuō)明顆粒是否均勻一致。
三、影響膠體金顆粒大小的因素
如果有較多的大小不等的金顆粒及有橢圓形，三角形金顆粒存在應(yīng)重新制備。一般造成這種情況的主要原因是在加還原劑的時(shí)候不是迅速一次加入，而是多次加入。再者攪拌不均勻，速度太慢沒(méi)有攪拌起來(lái)，造成了顆粒大小不等。制備量的多少，容器的大小，加熱的時(shí)間等也影響膠體金顆粒的大小。制備了合格的膠體金以后，放在室溫或4℃保存。避免低溫凍存，因?yàn)閮龃婵蓪?dǎo)致膠體金凝集，破壞了膠體狀態(tài)。膠體金在室溫避光無(wú)灰塵的環(huán)境中可放置3個(gè)月左右。冰箱內(nèi)半年左右。根據(jù)膠體金的性質(zhì)，有不穩(wěn)定和聚沉的可能性，因此，制備完畢后在20天以內(nèi)進(jìn)行標(biāo)記。
第五節(jié)膠體金標(biāo)記物的制備
膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的原理，一般認(rèn)為是由于pH值等于或稍偏堿于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)呈電中性，此時(shí)蛋白質(zhì)分子與膠體金顆粒相互間的靜電作用較小，但蛋白質(zhì)分子的表面張力卻zui大，處于一種微弱的水化狀態(tài)，較易吸附于金顆粒的表面，由于蛋白質(zhì)分子牢固地結(jié)合在金顆粒的表面，形成一個(gè)蛋白層，阻止了膠體金顆粒的相互接觸，而使膠體金處于穩(wěn)定狀態(tài)，如果＝低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，膠體金帶負(fù)電荷，二者極易靜電結(jié)合形成大的聚合物。如果pH高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，與金顆粒的負(fù)電荷相互排斥而不能互相結(jié)合。為防止蛋白質(zhì)與膠體金的聚合與沉淀，常用牛血清白蛋白，卵白蛋白，聚乙二醇或明膠作穩(wěn)定劑。用Sephacryb
S?400 （丙烯葡聚糖S?400 ）層析分離純化膠體金蛋白標(biāo)記物只適用于以BSA作穩(wěn)定劑者。
一、待標(biāo)記蛋白質(zhì)的準(zhǔn)備
（1）透析除鹽：蛋白質(zhì)溶液內(nèi)應(yīng)除去多余的電解質(zhì)，不然過(guò)高的鹽類物質(zhì)會(huì)降低膠體金顆粒的Zeta電位，影響蛋白質(zhì)的吸附，因此，標(biāo)記之前必須*除鹽。一般將蛋白質(zhì)置入透析袋中然后直接放入雙蒸水或極低濃度的鹽水（0.005mol/L NaCl , pH7.0）透析。
（2）去除蛋白質(zhì)中的沉淀：長(zhǎng)期低溫保存的蛋白質(zhì)或4℃較長(zhǎng)時(shí)間保存的抗體，特別是在濃度高于2mg/ml的情況下，很容易形成聚合物，聚合物對(duì)標(biāo)記過(guò)程及免疫金探針的穩(wěn)定性有一定影響，因此，標(biāo)記之前須離心以除去這些聚合物。一般以100000r/min 4℃離心60min取上清液，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度至1mg./ml即可用于標(biāo)記。
二、膠體金pH值的調(diào)整
膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（PI）略偏堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合，因此，標(biāo)記之前須將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿。需要提高膠體金的pH值時(shí)可用0.1molK2CO3，需要降低膠體金的pH值時(shí)可用0.1N HCl。測(cè)定金溶液的pH可能損害pH測(cè)定計(jì)的探頭，因此，一般用精密的pH試紙測(cè)定其pH即可。
幾種常用的蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金所用的pH值見(jiàn)表5-4。
表5-4 常用幾種蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金所用的pH值如下
蛋白質(zhì)pH
抗體（γ球蛋白）9.0
親合層析的IgG7.6
單克隆抗體8.2
F（ab'）27.2
SPA（葡萄球菌蛋白）6.0
蓖麻子植物凝血素Ⅰ8.0
蓖麻子植物凝血素Ⅱ8.0
花生凝集素6.3
Helix pomatia lectin7.4
大豆凝集素6.1
Lens Culinaris lectin6.9
Lotus Tetragonolobus lectin6.3
荊豆凝集素6.3
Bandeirae simplicifolia lectin6.2
過(guò)氧化物酶8.0
類卵粘蛋白4.8
血漿銅蘭蛋白7.0
α-胎球蛋白6.5
小牛血清白蛋白6.5
牛血清白蛋白5.5
牛血球白蛋白結(jié)合肽4.5
牛血清白蛋白結(jié)合胰島素5.3
霍亂毒素6.9
破傷風(fēng)毒素6.9
DNAase6.0
RNAase9.0
低密度脂蛋白5.5
α2-巨球蛋白6.0
抗生物素蛋白（親合素）10.0
鏈霉抗生物素蛋白6.6
麥胚凝集素9.9
三、待標(biāo)記蛋白質(zhì)zui適穩(wěn)定量的測(cè)定
（1）光電比色法：制備一系列不同濃度的等體積蛋白質(zhì)溶液（1ml），分別加入5ml膠體金中，迅速混勻，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測(cè)各管。根據(jù)膠體金顆粒的大小，OD在520～580nm之間測(cè)定，以OD值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)用量為橫坐標(biāo)作一曲線，取曲線zui先與橫軸相接近的那一點(diǎn)處的蛋白質(zhì)用量為zui適穩(wěn)定量。圖5.2中10nm的膠體金溶液中蛋白質(zhì)的zui適穩(wěn)定量為45μg/ml
（2）目測(cè)法：以目測(cè)法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例，將標(biāo)記的蛋白質(zhì)逐級(jí)稀釋后（由5μg～45μg另設(shè)對(duì)照管），各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別加入0.1ml 10%氯化鈉，依表5-5順序進(jìn)行。
表5-5 具體的做法是按表內(nèi)進(jìn)行
管數(shù)12345678910
膠體金（ml）1111111111
蛋白質(zhì)（μg）510152025303540450
10%NaCl（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1
①當(dāng)分別加入0.1ml 10%氯化鈉后、混勻靜置2h以上觀察結(jié)果。
②沒(méi)有加入蛋白質(zhì)的管為對(duì)照管。
③小于5nm顆粒的膠體金溶液，每個(gè)管內(nèi)應(yīng)加入5μl33%的雙氧水，否則有不變藍(lán)色及聚沉現(xiàn)象。未加蛋白及加入蛋白量不足以穩(wěn)定膠體金的試管，即呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而加入蛋白量達(dá)到或超過(guò)zui低穩(wěn)定量的試管則膠體金的紅顏色不變。其中含蛋白量zui低的試管即含穩(wěn)定1ml膠體金的必須蛋白量。在此基礎(chǔ)上再加上20%即為穩(wěn)定所需蛋白質(zhì)的實(shí)際用量。
四、蛋白質(zhì)的膠體金標(biāo)記
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的zui適穩(wěn)定量及標(biāo)記的*pH值被確定以后便可進(jìn)行標(biāo)記。具體步驟如下：
（1）根據(jù)用以標(biāo)記的膠體金的總量計(jì)算出所需要的待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量。
（2）在電磁攪拌下，將蛋白質(zhì)溶液加入膠體金溶液中（pH已調(diào)至PI超過(guò)0.5pH），加入蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)逐滴加入，1mg的蛋白質(zhì)大約5min加完。
（3）在磁性攪拌下加入5%的牛血清白蛋白（BSA）使其終濃度為1%，或加入3%聚乙二醇（PEG MW20000）使其終濃度為0.05%,
我們對(duì)比了BSA和PEG穩(wěn)定膠體金的效果，BSA穩(wěn)定的標(biāo)記膠體金，放在4℃達(dá)2年半仍然保持良好性能，而用PEG穩(wěn)定的標(biāo)記膠體金放在4℃1年左右就有分層現(xiàn)象，而且染色*下降。因此，我們認(rèn)為還是用BSA作穩(wěn)定劑。
（4）將標(biāo)記好的膠體金裝入透析袋中，兩頭扎緊，放入蔗糖或硅膠中濃縮，濃縮到原體積的1/10量，濃縮完畢后純化。離心法純化時(shí)，不要濃縮。
五、膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的純化
標(biāo)記好的免疫金探針必須經(jīng)過(guò)純化處理以后才能用于免疫細(xì)胞化學(xué)染色。純化的目的是除去其中未標(biāo)記的蛋白質(zhì)，未充分標(biāo)記的膠體金以及在標(biāo)記過(guò)程中可能形成的各種聚合物。
（一）調(diào)整與超速離心法
（1）將標(biāo)記的大于10nm的膠體金溶液選用15000r/min 4℃離心15min，吸出上清，棄去沉淀，以去除大的聚合物。
（2）一般在10nm以上所標(biāo)記的膠體金均可在調(diào)整離心機(jī)上離心，小于10nm顆粒的膠體金用超速離心機(jī)離心，在4℃離心1h左右，棄上清，將沉淀以原體積的0.02mol./L
TBSpH8.2（內(nèi)含1%BSA，0.05%疊氮鈉）溶解，重復(fù)離心2～3次，沉淀溶于原體積的1/10TBS中。4℃保存?zhèn)溆?。為了得到顆粒均勻一致的免疫金試劑，上述粗提制劑可用10%～30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度離心，分帶收集不同大小顆粒的膠體金標(biāo)記蛋白制劑。
幾種免疫金探針離心所用轉(zhuǎn)速（見(jiàn)表5-6），離心純化時(shí)所用轉(zhuǎn)速見(jiàn)表5-7，膠體金的OD值見(jiàn)表5-8。
表5-6 幾種免疫金探針離心時(shí)所用轉(zhuǎn)速參考表
膠體金顆粒直徑（nm）蛋白質(zhì)時(shí)間（min）轉(zhuǎn)速（r）
3.0GAR IgG6030000
5.0GAR IgG5025000
10.0RAM IgG5019000
15.0SPA4017000
15.0ALcc IgG4017000
20.0SPA4013000
25.0SPA3512000
說(shuō)明：GAR IgG=羊抗兔IgG；RAM IgG=兔抗鼠IgG；ALcc IgG=抗肝細(xì)胞癌IgG; SPA=葡萄球菌A蛋白
表5-7 幾種免疫金探針離心純化時(shí)所用轉(zhuǎn)速
膠體金顆粒（nm）pH蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)速（xg）時(shí)間（min）
59.0羊抗人IgG4500045
108.2抗胃癌單克隆抗體4500030
156.5鏈霉親和素1200045
206.0SPA1200030
將純化好的膠體金用0.02mol/L TBS緩沖液作1：20稀釋，用520nm測(cè)OD值。
表5-8 不同大小膠體金的OD值
膠體金顆粒大?。?/span>nm）OD（520）nm
52.5
102.5
153.5
205.0
（二）凝膠過(guò)濾法
為純化免疫金探針的方法，其特點(diǎn)是簡(jiǎn)便，過(guò)濾的膠體金顆粒比較均勻，不容易凝集，而離心方法轉(zhuǎn)速高，時(shí)間長(zhǎng)，膠體金顆粒沉淀容易凝集，用凝膠過(guò)濾克服了這一弱點(diǎn)。選用本方法時(shí)膠體金溶液必須用牛血清白蛋白作穩(wěn)定劑。具體操作過(guò)程如下：
（1）將濃縮好的膠體金以1500r/min離心去掉大的聚合物。吸出上清待過(guò)柱。
（2）柱高34cm,直徑1cm,加樣體積為柱床體積的1/10。
（3）丙烯葡聚糖S-400（Sephacryls?400 , Pharmacia, Sweden）裝柱后用0.02mol/L pH8.2
TBS平衡層析柱（pH7.4者用于標(biāo)記的SPA），平衡好后，吸取上清膠體金液體加入層析柱內(nèi)，加樣時(shí)請(qǐng)注意不要破壞S?400的界面。
（4）用0.02mol/L pH8.2
TBS洗脫，先行濾出的液體有少量微黃不透亮的液體，緊接著是濃度高紅色而透亮的膠體金，注意顏色的變化，如紅色變淡，變黃立刻停止收集。如Sephacryls?400沒(méi)有，也可以用Sepharose ?4B或6B代替（Pharmacia, Sweden）也能收到較好的效果。
六、免疫金探針的鑒定
（1）用有Formvar
膜的鎳網(wǎng)沾取金標(biāo)蛋白溶液，空氣中干燥后醋酸鈾復(fù)染，在TEM下觀察，可見(jiàn)金顆粒周圍有一明顯的空暈，表示顆粒表面吸附有蛋白質(zhì)分子。
（2）純化后免疫金探針是否保持很好的生物學(xué)活性是判斷其質(zhì)量好壞的主要指標(biāo)，因此，在使用之前必須對(duì)它的特異性，敏感性進(jìn)行鑒定。鑒定舉例，用陽(yáng)性抗原片，脫蠟至水，胰蛋白酶消化，加*抗體（多克隆或單克隆），一般過(guò)夜再加標(biāo)記抗同一抗特異性抗體結(jié)合的膠體金溶液（多克隆或單克隆抗體標(biāo)記的膠體金）詳細(xì)方法步驟見(jiàn)后IgGS法，一般做1：2，1：4，1：8，1：16，稀釋SPA-金，做1：10，1：20，1：40，1：80稀釋，37℃45min，沖洗，顯色，觀察結(jié)果，染色效價(jià)以陽(yáng)性結(jié)果明確，背景淺的稀釋度為標(biāo)準(zhǔn)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色試驗(yàn)可以較全面地反應(yīng)免疫金探針的質(zhì)量。
膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的原理，一般認(rèn)為是由于pH值等于或稍偏堿于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)呈電中性，此時(shí)蛋白質(zhì)分子與膠體金顆粒相互間的靜電作用較小，但蛋白質(zhì)分子的表面張力卻zui大，處于一種微弱的水化狀態(tài)，較易吸附于金顆粒的表面，由于蛋白質(zhì)分子牢固地結(jié)合在金顆粒的表面，形成一個(gè)蛋白層，阻止了膠體金顆粒的相互接觸，而使膠體金處于穩(wěn)定狀態(tài)，如果＝低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，膠體金帶負(fù)電荷，二者極易靜電結(jié)合形成大的聚合物。如果pH高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，與金顆粒的負(fù)電荷相互排斥而不能互相結(jié)合。為防止蛋白質(zhì)與膠體金的聚合與沉淀，常用牛血清白蛋白，卵白蛋白，聚乙二醇或明膠作穩(wěn)定劑。用Sephacryb
S?400 （丙烯葡聚糖S?400 ）層析分離純化膠體金蛋白標(biāo)記物只適用于以BSA作穩(wěn)定劑者。
一、待標(biāo)記蛋白質(zhì)的準(zhǔn)備
（1）透析除鹽：蛋白質(zhì)溶液內(nèi)應(yīng)除去多余的電解質(zhì)，不然過(guò)高的鹽類物質(zhì)會(huì)降低膠體金顆粒的Zeta電位，影響蛋白質(zhì)的吸附，因此，標(biāo)記之前必須*除鹽。一般將蛋白質(zhì)置入透析袋中然后直接放入雙蒸水或極低濃度的鹽水（0.005mol/L NaCl , pH7.0）透析。
（2）去除蛋白質(zhì)中的沉淀：長(zhǎng)期低溫保存的蛋白質(zhì)或4℃較長(zhǎng)時(shí)間保存的抗體，特別是在濃度高于2mg/ml的情況下，很容易形成聚合物，聚合物對(duì)標(biāo)記過(guò)程及免疫金探針的穩(wěn)定性有一定影響，因此，標(biāo)記之前須離心以除去這些聚合物。一般以100000r/min 4℃離心60min取上清液，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度至1mg./ml即可用于標(biāo)記。
二、膠體金pH值的調(diào)整
膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（PI）略偏堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合，因此，標(biāo)記之前須將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿。需要提高膠體金的pH值時(shí)可用0.1molK2CO3，需要降低膠體金的pH值時(shí)可用0.1N HCl。測(cè)定金溶液的pH可能損害pH測(cè)定計(jì)的探頭，因此，一般用精密的pH試紙測(cè)定其pH即可。
幾種常用的蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金所用的pH值見(jiàn)表5-4。
表5-4 常用幾種蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金所用的pH值如下
蛋白質(zhì)pH
抗體（γ球蛋白）9.0
親合層析的IgG7.6
單克隆抗體8.2
F（ab'）27.2
SPA（葡萄球菌蛋白）6.0
蓖麻子植物凝血素Ⅰ8.0
蓖麻子植物凝血素Ⅱ8.0
花生凝集素6.3
Helix pomatia lectin7.4
大豆凝集素6.1
Lens Culinaris lectin6.9
Lotus Tetragonolobus lectin6.3
荊豆凝集素6.3
Bandeirae simplicifolia lectin6.2
過(guò)氧化物酶8.0
類卵粘蛋白4.8
血漿銅蘭蛋白7.0
α-胎球蛋白6.5
小牛血清白蛋白6.5
牛血清白蛋白5.5
牛血球白蛋白結(jié)合肽4.5
牛血清白蛋白結(jié)合胰島素5.3
霍亂毒素6.9
破傷風(fēng)毒素6.9
DNAase6.0
RNAase9.0
低密度脂蛋白5.5
α2-巨球蛋白6.0
抗生物素蛋白（親合素）10.0
鏈霉抗生物素蛋白6.6
麥胚凝集素9.9
三、待標(biāo)記蛋白質(zhì)zui適穩(wěn)定量的測(cè)定
（1）光電比色法：制備一系列不同濃度的等體積蛋白質(zhì)溶液（1ml），分別加入5ml膠體金中，迅速混勻，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測(cè)各管。根據(jù)膠體金顆粒的大小，OD在520～580nm之間測(cè)定，以OD值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)用量為橫坐標(biāo)作一曲線，取曲線zui先與橫軸相接近的那一點(diǎn)處的蛋白質(zhì)用量為zui適穩(wěn)定量。圖5.2中10nm的膠體金溶液中蛋白質(zhì)的zui適穩(wěn)定量為45μg/ml
（2）目測(cè)法：以目測(cè)法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例，將標(biāo)記的蛋白質(zhì)逐級(jí)稀釋后（由5μg～45μg另設(shè)對(duì)照管），各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別加入0.1ml 10%氯化鈉，依表5-5順序進(jìn)行。
表5-5 具體的做法是按表內(nèi)進(jìn)行
管數(shù)12345678910
膠體金（ml）1111111111
蛋白質(zhì)（μg）510152025303540450
10%NaCl（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1
①當(dāng)分別加入0.1ml 10%氯化鈉后、混勻靜置2h以上觀察結(jié)果。
②沒(méi)有加入蛋白質(zhì)的管為對(duì)照管。
③小于5nm顆粒的膠體金溶液，每個(gè)管內(nèi)應(yīng)加入5μl33%的雙氧水，否則有不變藍(lán)色及聚沉現(xiàn)象。未加蛋白及加入蛋白量不足以穩(wěn)定膠體金的試管，即呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而加入蛋白量達(dá)到或超過(guò)zui低穩(wěn)定量的試管則膠體金的紅顏色不變。其中含蛋白量zui低的試管即含穩(wěn)定1ml膠體金的必須蛋白量。在此基礎(chǔ)上再加上20%即為穩(wěn)定所需蛋白質(zhì)的實(shí)際用量。
四、蛋白質(zhì)的膠體金標(biāo)記
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的zui適穩(wěn)定量及標(biāo)記的*pH值被確定以后便可進(jìn)行標(biāo)記。具體步驟如下：
（1）根據(jù)用以標(biāo)記的膠體金的總量計(jì)算出所需要的待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量。
（2）在電磁攪拌下，將蛋白質(zhì)溶液加入膠體金溶液中（pH已調(diào)至PI超過(guò)0.5pH），加入蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)逐滴加入，1mg的蛋白質(zhì)大約5min加完。
（3）在磁性攪拌下加入5%的牛血清白蛋白（BSA）使其終濃度為1%，或加入3%聚乙二醇（PEG MW20000）使其終濃度為0.05%,
我們對(duì)比了BSA和PEG穩(wěn)定膠體金的效果，BSA穩(wěn)定的標(biāo)記膠體金，放在4℃達(dá)2年半仍然保持良好性能，而用PEG穩(wěn)定的標(biāo)記膠體金放在4℃1年左右就有分層現(xiàn)象，而且染色*下降。因此，我們認(rèn)為還是用BSA作穩(wěn)定劑。
（4）將標(biāo)記好的膠體金裝入透析袋中，兩頭扎緊，放入蔗糖或硅膠中濃縮，濃縮到原體積的1/10量，濃縮完畢后純化。離心法純化時(shí)，不要濃縮。
五、膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的純化
標(biāo)記好的免疫金探針必須經(jīng)過(guò)純化處理以后才能用于免疫細(xì)胞化學(xué)染色。純化的目的是除去其中未標(biāo)記的蛋白質(zhì)，未充分標(biāo)記的膠體金以及在標(biāo)記過(guò)程中可能形成的各種聚合物。
（一）調(diào)整與超速離心法
（1）將標(biāo)記的大于10nm的膠體金溶液選用15000r/min 4℃離心15min，吸出上清，棄去沉淀，以去除大的聚合物。
（2）一般在10nm以上所標(biāo)記的膠體金均可在調(diào)整離心機(jī)上離心，小于10nm顆粒的膠體金用超速離心機(jī)離心，在4℃離心1h左右，棄上清，將沉淀以原體積的0.02mol./L
TBSpH8.2（內(nèi)含1%BSA，0.05%疊氮鈉）溶解，重復(fù)離心2～3次，沉淀溶于原體積的1/10TBS中。4℃保存?zhèn)溆?。為了得到顆粒均勻一致的免疫金試劑，上述粗提制劑可用10%～30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度離心，分帶收集不同大小顆粒的膠體金標(biāo)記蛋白制劑。
幾種免疫金探針離心所用轉(zhuǎn)速（見(jiàn)表5-6），離心純化時(shí)所用轉(zhuǎn)速見(jiàn)表5-7，膠體金的OD值見(jiàn)表5-8。
表5-6 幾種免疫金探針離心時(shí)所用轉(zhuǎn)速參考表
膠體金顆粒直徑（nm）蛋白質(zhì)時(shí)間（min）轉(zhuǎn)速（r）
3.0GAR IgG6030000
5.0GAR IgG5025000
10.0RAM IgG5019000
15.0SPA4017000
15.0ALcc IgG4017000
20.0SPA4013000
25.0SPA3512000
說(shuō)明：GAR IgG=羊抗兔IgG；RAM IgG=兔抗鼠IgG；ALcc IgG=抗肝細(xì)胞癌IgG; SPA=葡萄球菌A蛋白
表5-7 幾種免疫金探針離心純化時(shí)所用轉(zhuǎn)速
膠體金顆粒（nm）pH蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)速（xg）時(shí)間（min）
59.0羊抗人IgG4500045
108.2抗胃癌單克隆抗體4500030
156.5鏈霉親和素1200045
206.0SPA1200030
將純化好的膠體金用0.02mol/L TBS緩沖液作1：20稀釋，用520nm測(cè)OD值。
表5-8 不同大小膠體金的OD值
膠體金顆粒大?。?/span>nm）OD（520）nm
52.5
102.5
153.5
205.0
（二）凝膠過(guò)濾法
為純化免疫金探針的方法，其特點(diǎn)是簡(jiǎn)便，過(guò)濾的膠體金顆粒比較均勻，不容易凝集，而離心方法轉(zhuǎn)速高，時(shí)間長(zhǎng)，膠體金顆粒沉淀容易凝集，用凝膠過(guò)濾克服了這一弱點(diǎn)。選用本方法時(shí)膠體金溶液必須用牛血清白蛋白作穩(wěn)定劑。具體操作過(guò)程如下：
（1）將濃縮好的膠體金以1500r/min離心去掉大的聚合物。吸出上清待過(guò)柱。
（2）柱高34cm,直徑1cm,加樣體積為柱床體積的1/10。
（3）丙烯葡聚糖S-400（Sephacryls?400 , Pharmacia, Sweden）裝柱后用0.02mol/L pH8.2
TBS平衡層析柱（pH7.4者用于標(biāo)記的SPA），平衡好后，吸取上清膠體金液體加入層析柱內(nèi)，加樣時(shí)請(qǐng)注意不要破壞S?400的界面。
（4）用0.02mol/L pH8.2
TBS洗脫，先行濾出的液體有少量微黃不透亮的液體，緊接著是濃度高紅色而透亮的膠體金，注意顏色的變化，如紅色變淡，變黃立刻停止收集。如Sephacryls?400沒(méi)有，也可以用Sepharose ?4B或6B代替（Pharmacia, Sweden）也能收到較好的效果。
六、免疫金探針的鑒定
（1）用有Formvar
膜的鎳網(wǎng)沾取金標(biāo)蛋白溶液，空氣中干燥后醋酸鈾復(fù)染，在TEM下觀察，可見(jiàn)金顆粒周圍有一明顯的空暈，表示顆粒表面吸附有蛋白質(zhì)分子。
（2）純化后免疫金探針是否保持很好的生物學(xué)活性是判斷其質(zhì)量好壞的主要指標(biāo)，因此，在使用之前必須對(duì)它的特異性，敏感性進(jìn)行鑒定。鑒定舉例，用陽(yáng)性抗原片，脫蠟至水，胰蛋白酶消化，加*抗體（多克隆或單克隆），一般過(guò)夜再加標(biāo)記抗同一抗特異性抗體結(jié)合的膠體金溶液（多克隆或單克隆抗體標(biāo)記的膠體金）詳細(xì)方法步驟見(jiàn)后IgGS法，一般做1：2，1：4，1：8，1：16，稀釋SPA-金，做1：10，1：20，1：40，1：80稀釋，37℃45min，沖洗，顯色，觀察結(jié)果，染色效價(jià)以陽(yáng)性結(jié)果明確，背景淺的稀釋度為標(biāo)準(zhǔn)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色試驗(yàn)可以較全面地反應(yīng)免疫金探針的質(zhì)量。
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| SETS10 | Test Strips Pack of 10 10 | 10包 | 1000 | BBInternational |
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| ArraySC40 | Microarray Silver Colloid 40nm | 20ml | 2800 | BBInternational |
| ArraySC60 | Microarray Silver Colloid 60nm | 20ml | 2800 | BBInternational |
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| EMSC20 | 膠體銀 20nm | 20ml | 1340 | BBInternational |
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| EMSC40 | 膠體銀 40nm | 100ML | 3520 | BBInternational |
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| EMSC80 | 膠體銀 80nm | 500ML | 10340 | BBInternational |
| GCIKITLIFE | 膠體金5nm/10nm/20nm/40nm | 20 ml of each | 3220 | BBInternational |
| GCIKITDIAG | 膠體金20nm/40nm/60nm/80nm | 20 ml of each | 3220 | BBInternational |
| GCKITDIAGPLUS | 膠體金20nm/40nm/60nm/80nm | 100 ml of each | 9400 | BBInternational |
| EMGC2 | 膠體金2nm | 20ml | 1340 | BBInternational |
| EMGC5 | 膠體金5nm | 20ml | 1340 | BBInternational |
| EMGC10 | 膠體金10nm | 20ml | 1340 | BBInternational |
| EMGC15 | 膠體金15nm | 20ml | 1340 | BBInternational |
| EMGC20 | 膠體金20nm | 20ml | 1340 | BBInternational |
| EMGC30 | 膠體金30nm | 20ml | 1340 | BBInternational |
| EMGC40 | 膠體金40nm | 20ml | 1340 | BBInternational |
| EMGC50 | 膠體金50nm | 20ml | 1340 | BBInternational |
| EMGC60 | 膠體金60nm | 20ml | 1340 | BBInternational |
| EMGC80 | 膠體金80nm | 20ml | 1340 | BBInternational |
| EMGC100 | 膠體金100nm | 20ml | 1340 | BBInternational |
| EMGC150 | 膠體金150nm | 20ml | 1340 | BBInternational |
| EMGC200 | 膠體金200nm | 20ml | 1340 | BBInternational |
| EMGC250 | 膠體金250nm | 20ml | 1340 | BBInternational |
| EMGC2 | 膠體金2nm | 100ML | 3520 | BBInternational |
| EMGC5 | 膠體金5nm | 100ML | 3520 | BBInternational |
| EMGC10 | 膠體金10nm | 100ML | 3520 | BBInternational |
| EMGC15 | 膠體金15nm | 100ML | 3520 | BBInternational |
| EMGC20 | 膠體金20nm | 100ML | 3520 | BBInternational |
| EMGC30 | 膠體金30nm | 100ML | 3520 | BBInternational |
| EMGC40 | 膠體金40nm | 100ML | 3520 | BBInternational |
| EMGC50 | 膠體金50nm | 100ML | 3520 | BBInternational |
| EMGC60 | 膠體金60nm | 100ML | 3520 | BBInternational |
| EMGC80 | 膠體金80nm | 100ML | 3520 | BBInternational |
| EMGC100 | 膠體金100nm | 100ML | 3520 | BBInternational |
| EMGC150 | 膠體金150nm | 100ML | 3520 | BBInternational |
| EMGC200 | 膠體金200nm | 100ML | 3520 | BBInternational |
| EMGC250 | 膠體金250nm | 100ML | 3520 | BBInternational |
| EMGC2 | 膠體金2nm | 500ML | 10340 | BBInternational |
| EMGC5 | 膠體金5nm | 500ML | 10340 | BBInternational |
| EMGC10 | 膠體金10nm | 500ML | 10340 | BBInternational |
| EMGC15 | 膠體金15nm | 500ML | 10340 | BBInternational |
| EMGC20 | 膠體金20nm | 500ML | 10340 | BBInternational |
| EMGC30 | 膠體金30nm | 500ML | 10340 | BBInternational |
| EMGC40 | 膠體金40nm | 500ML | 10340 | BBInternational |
| EMGC50 | 膠體金50nm | 500ML | 10340 | BBInternational |
| EMGC60 | 膠體金60nm | 500ML | 10340 | BBInternational |
| EMGC80 | 膠體金80nm | 500ML | 10340 | BBInternational |
| EMGC100 | 膠體金100nm | 500ML | 10340 | BBInternational |
| EMGC150 | 膠體金150nm | 500ML | 10340 | BBInternational |
| EMGC200 | 膠體金200nm | 500ML | 10340 | BBInternational |
| EMGC250 | 膠體金250nm | 500ML | 10340 | BBInternational |