Elisa試驗(yàn)是一種敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷較客觀等因素，已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中。ELISA檢測(cè)試劑盒是用于體外定性檢測(cè)人血清或血漿中的抗人類戊型肝炎（HEV）病毒 IgM 抗體ELISA檢測(cè)。

       （一）ELISA測(cè)定技術(shù)的發(fā)展　　然而，影響Elisa試驗(yàn)結(jié)果的因素很多，故加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。

　　一、Elisa試劑盒測(cè)定技術(shù)的發(fā)展

　　臨床測(cè)定技術(shù)的發(fā)展主要在于方法學(xué)的發(fā)展，而方法學(xué)的發(fā)展依托于試劑生產(chǎn)技術(shù)不斷進(jìn)步更新和型標(biāo)記物的應(yīng)用。目前，分子生物學(xué)正在并zui終肯定會(huì)讓我們對(duì)整個(gè)生命科學(xué)有一個(gè)全面而*的認(rèn)識(shí)，其對(duì)免疫測(cè)定技術(shù)發(fā)展的影響也是直接而又有效的，它使我們對(duì)以前一些難以檢測(cè)的生物活性物質(zhì)的測(cè)定變得輕而易舉，并且大大提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性。

　　1、基因工程試劑對(duì)免疫測(cè)定技術(shù) 發(fā)展的影響

　　免疫測(cè)定技術(shù)的基礎(chǔ)在于抗原抗體之間的特異結(jié)合反應(yīng)，所以任何的診斷試劑離不開的原料，如抗原抗體，酶等。以前用于免疫測(cè)定的抗原通常為各種純化抗原，而抗體則為純化抗原免疫動(dòng)物后獲得的多克隆抗體和使用雜交瘤技術(shù)得到的單克隆抗體，而抗原或抗體的標(biāo)記物如酶標(biāo)結(jié)合物則通過(guò)各總化學(xué)合成方法制備。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，使用基因工程方法制備各種特殊的抗原或抗體及其酶結(jié)合物等免疫測(cè)定試劑幾成為現(xiàn)實(shí)的新一代試劑，各種新型使用的測(cè)定方法也不斷出現(xiàn)。

　　HBsAg試劑特點(diǎn)（檢測(cè)模式：臨 床抗體夾心法）：

　　包被抗體為山羊多抗，多抗具有高親和性和對(duì)抗原各種表位的反應(yīng)性。

　　酶表抗體為與HBsAg有不同結(jié)合位點(diǎn)的鼠復(fù)合單位。

　　可測(cè)得HBsAg變異樣品。

　　提高檢測(cè)的特異性（99.98%）

　　提高檢測(cè)的靈敏度，應(yīng)用Parl Ehrich 學(xué)說(shuō)（PEI）HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)ad標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度為0.05nｇ/ml對(duì)ay標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度為0.025ng/ml

　　elisa試劑盒的用途

　　測(cè)試劑盒檢測(cè)原理

　　ELISA檢測(cè)試劑盒應(yīng)用定性?shī)A心免疫檢測(cè)技術(shù)，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板條，這些多肽是中國(guó)型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很強(qiáng)的肽段，分別來(lái)自于該毒株的開放閱讀框2和開放閱讀框3。將樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM抗體，這些抗體就會(huì)與HEV 的多肽抗原結(jié)合，并固定在上面，洗板除去其它非特異性抗體和樣品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根過(guò)氧化物酶）酶結(jié)合物，經(jīng)第二次孵育后，酶結(jié)合物就會(huì)與*次孵育結(jié)合上的HEV IgM抗體相結(jié)合，洗板除去未結(jié)合的酶結(jié)合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育時(shí)會(huì)發(fā)生酶-底物反應(yīng)，只有那些含有HEV IgM抗體和酶結(jié)合物所形成的復(fù)合物的孔才會(huì)發(fā)生顏色變化，加入硫酸溶液終止酶和底物間的反應(yīng)，并在波長(zhǎng): 450nm處測(cè)量O.D.值,按照本HEV IgM抗體elisa試劑盒 的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn), O.D.值大于或等于Cut-Off值的樣品被認(rèn)為是初試陽(yáng)性

     （二）　操作步驟　　方法一　用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法:

　　1.　包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡(jiǎn)稱洗滌，下同）。

　　方法二　用于檢測(cè)未知抗體的間接法：

　　用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，

　　每孔加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日洗滌3次。

　　↓

　　加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔

　　中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。（同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照）

　　↓

　　于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml，

　　37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。

　　↓

　　其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

   （三）　試劑器材　　1.　試劑

　?。?）　包被緩沖液（PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液）:

　　NaHCO３ 1.59克

　　NaHCO３　2.93克

　　加蒸餾水至1000ml

　　（2）　洗滌緩沖液（PH7.4PBS）：0.15M

　　KH2PO4 0.2克

　　Na2HPO４·12H2O　2.9克

　　NaCl　8.0克

　　KCl　0.2克

　　Tween-20　0.05％　0.5ml

　　加蒸餾水至1000ml

　?。?）　稀釋液：

　　牛血清白蛋白（BSA） 0.1克

　　加洗滌緩沖液至100ml

　　或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5～10％使用。

　　（4）　終止液（2M　H２SO４）：

　　蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98％）21.7ml。

　?。?）　底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:

　　0.2MNa２HPO４（28.4克／L）25.7ml

　　0.1M檸檬酸（19.2克／L）　24.3ml

　　加蒸餾水50ml。

　?。?）　TMB（四甲基聯(lián)苯胺）使用液:

　　TMB（10mg／5ml無(wú)水乙醇）0.5ml

　　底物緩沖液（PH5.5）　10ml

　　0.75％H２O２　32μl

　?。?）　ABTS使用液:

　　ABTS　0.5mg

　　底物緩沖液（PH5.5）　1ml

　　3％H２O２　2μl

　?。?）　抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。

　?。?）　正常人血清和陽(yáng)性對(duì)照血清。

　　2.　器材:

　　（1）　聚苯乙烯塑料板（簡(jiǎn)稱酶標(biāo)板）40孔或96孔，ELISA檢測(cè)儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

　?。?）　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

　　（3）　4℃冰箱，37℃孵育箱。

    （四）試劑盒的清洗

　　自備材料

　　安全性

　　操作注意事項(xiàng)

  （五）　注意事項(xiàng)　　

   1.　正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。