| 試劑盒組成 | K5000 | K5001 | 儲存溫度 |
| 1NFolin-Ciocalteu Reagent Solution CTC Solution SoSDS BSAStandard （0.5mg/ml） | 20ml 40ml 40ml 4X 1 ml | 50ml 2X 50ml 2X 50ml 4X 1ml | 4度 室溫 室溫 室溫或-20度 |
注意：
1.溫度過低時，溶液中如果有鹽析，需要保溫使其溶解后使用。
2.BSA使用前，需要用水稀釋到濃度為0.05mg/ml。
原理：
蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基與Folin-Ciocalteu酚試劑反應(yīng)形成的有顏色的復(fù)合物，比較與已知蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)BSA形成的顏色從而確定未知蛋白質(zhì)的含量。
注意：
1.該方法檢測的蛋白質(zhì)濃度范圍1ug-50ug/ml。
2.Folin-Ciocalteu酚試劑的穩(wěn)定期至少1年，CTC Solution穩(wěn)定期為六個月。使用前根據(jù)需要的量取等體積的Solution CTC和Solution SoSDS混勻后，得到CTC Working Solution.混合后的必須在24小時內(nèi)用完。。
3.由于Lowry法測定的是蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基，對于那些酪氨酸殘基數(shù)高于或低于BSA,其測定的蛋白質(zhì)含量將偏低或偏高。如果遇到該情況，需要采用BCA或Bradford法測定。
4.閱讀測定方法后化學(xué)試劑對測定方法的影響。
測定方法（試管法）：
1.BSA標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的準(zhǔn)備：樣品用水或其他不干擾顯色反應(yīng)的緩沖配置，使待測定的濃度位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分。每個反應(yīng)準(zhǔn)備3個平行測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線一般5-6個點即可，根據(jù)樣品的濃度確定各點的具體濃度。稀釋BSA時,可以用水，采用與樣品*或近似的溶液。
2.標(biāo)準(zhǔn)BSA使用前，需要用水稀釋到濃度為0.05mg/ml。可以在1.5ml Eppendorf管內(nèi)做反應(yīng)。在管壁上依次標(biāo)上序列號，按下表所列在管內(nèi)加BSA標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。注意：每次反應(yīng)都需要做一個和未知樣品溶液相同的空白對照。樣品如果濃度高于50ug/ml,需要用水或合適的緩沖稀釋，記錄稀釋的倍數(shù)。
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 待測樣品 稀釋1 | 待測樣品 稀釋2 |
| BSA （μl）（50ug/ml） | 0 | 25 | 50 | 100 | 150 | 200 | 200 | 200 |
| H2O （μl） | 200 | 175 | 150 | 100 | 50 | 0 | 0 | 0 |
| CTC Working Solution, （μl） | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| | 蓋上蓋子，室溫反應(yīng)10分鐘 | |||||||
| 1NFolin-Ciocalteu Reagent （μl） | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| | 蓋上蓋子，室溫反應(yīng)30分鐘 | |||||||
| OD750 | | | | | | | | |
| | | | | | | | | |
| | | | | | | | | |
| OD750平均值 | | | | | | | | |
| Con （μg/ml） | 0 | 6.25 | 12.5 | 25 | 37.5 | 50 | | |
未知樣品濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得, 實際濃度需要乘以樣品的稀釋倍數(shù)
3.用容量為0.5ml、光徑為1cm的比色杯測定750nm的光吸收。注意：染料如果吸附到比色杯壁上，杯子可以用甲醇清洗。測定時，測定濃度由低到高，測定未知樣品時需要將杯子清洗干凈，空白先測定，然后樣品。
4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。注意：數(shù)據(jù)處理時需要去除明顯錯誤的值。未知樣品濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得。如果是計算機(jī)繪制得曲線，可以從計算機(jī)給出的線性方程式計算出未知樣品的濃度。
測定方法（96微孔板法）
1． BSA標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的準(zhǔn)備：樣品用水或其他不干擾顯色反應(yīng)的緩沖配置，使待測定的濃度位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分。每個反應(yīng)準(zhǔn)備3個平行測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線一般5-6個點即可，根據(jù)樣品的濃度確定各點的具體濃度。稀釋BSA時,可以用水，采用與樣品*或近似的溶液。
2． 標(biāo)準(zhǔn)BSA使用前，需要用水稀釋到濃度為0.05mg/ml。按下表所列在孔內(nèi)加BSA標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。注意：每次反應(yīng)都需要做一個和未知樣品溶液相同的空白對照。樣品如果濃度高于50ug/ml,需要用水或合適的緩沖稀釋，記錄稀釋的倍數(shù)。
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 待測樣品 稀釋1 | 待測樣品 稀釋2 |
| BSA （μl）（50ug/ml） | 0 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | 40 | 40 |
| H2O （μl） | 40 | 35 | 30 | 20 | 10 | 0 | 0 | 0 |
| CTC Working Solution, （μl） | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| | 蓋上96孔板蓋，室溫反應(yīng)10分鐘 | |||||||
| 1NFolin-Ciocalteu Reagent （μl） | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 |
| | 蓋上96孔板蓋，室溫反應(yīng)30分鐘 | |||||||
| OD750 | | | | | | | | |
| | | | | | | | | |
| | | | | | | | | |
| OD750平均值 | | | | | | | | |
| Con （μg/ml） | 0 | 6.25 | 12.5 | 25 | 37.5 | 50 | | |
未知樣品濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得, 實際濃度需要乘以樣品的稀釋倍數(shù)。
3． 用酶標(biāo)測試儀750nm測定光吸收。
4． 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。注意：數(shù)據(jù)處理時需要去除明顯錯誤的值。未知樣品濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得, 實際濃度需要乘以樣品的稀釋倍數(shù)。如果是計算機(jī)繪制得曲線，可以從計算機(jī)給出的線性方程式計算出未知樣品的濃度。注意：實際操作時不必每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以做一兩個標(biāo)準(zhǔn)樣品，和標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出濃度系數(shù)。未知樣品的實際濃度=從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到的濃度*濃度系數(shù)。
注意：
一、如果樣品中含有影響測定的物質(zhì)，按下法除去：
1． 用水將樣品調(diào)到體積為200ml, 加入20ml 0.15%去氧膽酸鈉，混勻，室溫放置10分鐘。
2． 加入20ml 72%的TCA,室溫放置5分鐘。
3． 3000X g離心15分鐘，小心去除上清，用200ml水溶解。此時的樣品可以用于測定。
二、常用化學(xué)試劑對Lowry法測定方法的影響
Glycin<100mM, HEPE<1mM, Imidazole<25mM, NaCl<1M, Tris<10mM, NaPi<100mM, CHAPS<0.05%, NP40<0.02%, SDS<1%, Trition X-100<0.03%, Tween<0.05%,EDTA<1mM, EGTA<1mM, Glucose<100mM, 2-Mercaptoethanol<1mM, Sodium Sitrate<100mM, Urea<3M, NaOH<100mM, PMSF<1mM, Sucrose<7%, Methanol<10%,DMSO<10%, Ethanol<10%, DMF<10%, Acetone<10%,Aprotinin<10mg.ml,.
NO DTT, No DTE and No Ammonium Sulfate （不能含DTE,DTT和硫酸胺）
化工儀器網(wǎng)