氯霉素 （Chloramphenicol, CAP） 是一種廣譜抗生素。具有良好的抗菌效果且價(jià)格低廉，廣泛應(yīng)用于家畜禽的各種傳染性疾病的治療。但是氯霉素有嚴(yán)重的副作用，它已被證實(shí)會(huì)抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等。近年來，食品中的氯霉素殘留對人類的健康造成了*的威脅。因此，發(fā)展快速、簡便而且又準(zhǔn)確的氯霉素檢驗(yàn)試劑成為了近年來食品分析界十分關(guān)注的課題。傳統(tǒng)上常用HPLC 與TLC 來作為抗生素檢測的方法，但效率低、靈敏度也達(dá)不到要求。本公司研發(fā)的氯霉素酶聯(lián)免疫檢驗(yàn)試劑盒，操作簡便、耗時(shí)短、檢測樣品多，特異性高，且檢測敏感度zui低可達(dá)0.025ppb。

本試劑可用于檢測生乳、蜂蜜、蜂王漿、魚、蝦、蟹、烏賊、雞肉、豬肉、飼料及血清等的氯霉素殘留。

本試劑盒采用直接競爭ELISA 法檢測樣本中氯霉素。在微孔板上預(yù)包被抗氯霉素抗體，樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的氯霉素和HRP 標(biāo)記的氯霉素競爭結(jié)合微孔板中抗氯霉素抗體，洗滌后用底物顯色，樣本吸光值與其所含氯霉素成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中氯霉素的含量。

每個(gè)試劑盒中的試劑可進(jìn)行48 個(gè)測定（包括標(biāo)準(zhǔn)測定），試劑盒組份：

CAPAb 酶標(biāo)板------------------------------48 孔（包被有抗氯霉素抗體）

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液-----------------------------6 瓶（1.5 mL/瓶）

0 號(hào)：0 ppb ；1 號(hào)：0.025 ppb ；2 號(hào)：0.05 ppb ；3 號(hào)：0.1 ppb ；4 號(hào)：0.3 ppb ；

5 號(hào)：0.6 ppb

氯霉素酶標(biāo)記物----------------------------------1 瓶（8mL）

10×濃縮洗滌液----------------------------------1 瓶（30mL）

10×濃縮提取劑----------------------------------1 瓶（30mL）

底物溶液----------------------------------------1 瓶（12mL）

終止液------------------------------------------1 瓶（12mL）

封板膜------------------------------------------3 張

說明書------------------------------------------1 份

質(zhì)檢報(bào)告----------------------------------------1 份

4.1 儀器

— 微孔板酶標(biāo)儀（450nm）

— 振蕩器

— 均質(zhì)機(jī)

— 離心機(jī)，離心管和玻璃試管

— 可調(diào)式5μL-50μL、 20μL-200μL 和100μL-1000μL 微量移液器

— 氮吹儀

4.2 試劑

— 乙酸乙酯（Ethyl acetate）

— 正己烷（n-Hexane）

— 0.5 N 鹽酸溶液（HCl）

— 0.5 N 氫氧化鈉溶液（NaOH）

5.1 待測物為生乳，請先參考注意事項(xiàng)第9，10點(diǎn)

− 現(xiàn)配1×提取劑：10×濃縮提取劑用蒸餾水稀釋10 倍后使用。（如1 mL 濃縮稀釋液加9 mL

蒸餾水稀釋）

− 取250μL 乳品于1.5mL 離心管

− 加入750μL 現(xiàn)配1×提取劑，快速震蕩30秒鐘后備用

稀釋倍數(shù): 4

5.2待測物為蜂蜜

− 取2 g蜂蜜、4mL蒸餾水與4mL乙酸乙酯于15mL離心管中，震蕩30秒

− 持續(xù)上下顛倒該離心管10分鐘，使其充分混合均勻

− 以5000rpm離心10分鐘，取1 mL上層液（乙酸乙酯）至10mL玻璃試管中，于50℃下，利用氮

氣將有機(jī)溶相吹干

− 加入0.5 mL 1×提取劑，震蕩30秒鐘后備用

稀釋倍數(shù): 1

5.3 待測物為蜂王漿

− 取2g蜂王漿、3mL 0.5M NaOH及8 mL乙酸乙酯置入15mL離心管中，震蕩30秒

− 持續(xù)上下顛倒該離心管10 分鐘，使其充分混合均勻

− 以5000rpm離心10分鐘，取2mL上層液（乙酸乙酯）至10 mL玻璃試管中，于50 ℃下，利用氮

氣將有機(jī)溶相吹干

− 加入0.5 mL1×提取劑，震蕩30秒鐘后備用

稀釋倍數(shù): 1

5.4 待測物為魚、蝦、蟹、烏賊、雞肉、豬肉及血清

− 將3克已均質(zhì)的樣品放入15mL離心管中，再加入6mL乙酸乙酯，震蕩5分鐘

− 以5000rpm離心10分鐘，取2mL上層液（乙酸乙酯）至10mL玻璃試管中，于50℃下，利用氮?dú)鈱⒂袡C(jī)溶相吹干

− 于此玻璃試管中加入正己烷1mL，先將殘余物*溶解后，再加入1mL 1×提取劑，震蕩30

秒鐘

− 以5000rpm離心10分鐘，吸去包含中間乳化層的上層液（正己烷），再吸取下層液（水層）備

用

稀釋倍數(shù): 1

5.5 待測物為白蝦

− 將6克已均質(zhì)的樣品放入15mL離心管中，再加入6 mL乙酸乙酯，震蕩5分鐘

− 以5000rpm離心10分鐘，取4mL上層液（乙酸乙酯）至10 mL玻璃試管中，于50℃下，利用氮

氣將有機(jī)溶相吹干

− 于此玻璃試管中加入正己烷2mL，先將殘余物*溶解后，再加入0.5mL 1×提取劑，震蕩30秒鐘

− 以5000rpm離心10分鐘，吸去包含中間乳化層的上層液（正己烷），再吸取下層液（水層）備

用稀釋倍數(shù): 0.125

5.6 待測物為飼料

− 取2 g飼料與4 mL乙酸乙酯置入15mL離心管中，震蕩30秒

− 持續(xù)上下顛倒該離心管10分鐘，使其充分混合均勻

− 以5000rpm離心10分鐘，取1mL上層液（乙酸乙酯）至10mL玻璃試管中，于50℃下，利用氮?dú)鈱⒂袡C(jī)溶相吹干

− 于此玻璃試管中加入正己烷1mL，先將殘余物*溶解后，再加入0.5mL 1×提取劑，震蕩30秒鐘

− 以5000rpm離心10分鐘，吸去包含中間乳化層的上層液（正己烷），再吸取下層液（水層）稀

釋10倍后（如50μL下層液加450μL 1×提取劑）備用

稀釋倍數(shù): 10

5.7 待測物為全蛋

− 取1 g全蛋液，加入0.5N HCl 0.5 mL后快速震蕩30秒

− 加入4mL乙酸乙酯后快速震蕩30秒使其混合均勻

− 以5000rpm離心10分鐘，取2mL上層液（乙酸乙酯）至10mL玻璃試管中，于50 ℃下，利用氮

氣將有機(jī)溶相吹干

− 于此玻璃試管中加入正己烷1mL，先將殘余物*溶解后，再加入0.5mL 1×提取劑，震蕩30秒

− 以5000rpm離心10分鐘，吸去包含中間乳化層的上層液（正己烷），再吸取下層液（水層）備

用。

稀釋倍數(shù): 1

注1：若乳化現(xiàn)象太嚴(yán)重，看不到下層液有澄清部分，請先將玻璃試管中大部分上層液取出，

剩余乳化部份用80～100℃水浴3分鐘后再離心。

注2：因?yàn)槔靡宜嵋阴ポ腿〉牧鞒炭赡苡腥軇┑谋尘爸颠^高的現(xiàn)象，建議做一個(gè)溶劑背景

值的樣品。待測物的濃度等于所得濃度減去溶劑背景值的濃度再乘以稀釋倍數(shù)。

注3：得到溶劑背景值的濃度的方法：不加待測物，從把適量的乙酸乙酯移入玻璃試管中做

起到完成整個(gè)提取流程，后用于檢測。

Ø 試劑盒保存于2-8°C，不能冷凍，未用的微孔板放回原鋁箔袋密封后2-8°C 存放，并

盡快使用，底物溶液要避光保存。

Ø 使用之前，將樣本及所需試劑的溫度平衡至20-25°C，否則可能導(dǎo)致后面檢測吸光度

值偏低。試劑使用完后應(yīng)立即放回2-8°C 冰箱。

Ø 10×提取劑與10×洗滌液用蒸餾水稀釋10 倍后使用。（如1 mL 濃縮液加9 mL 蒸餾水），

1×提取劑和1×洗滌液可于4 ℃保存一周。

Ø 提取流程請使用 P.P.材質(zhì)的15 mL 離心管以免腐蝕。

Ø 反應(yīng)終止液含0.5 N HCl，請小心操作。

Ø 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液含氯霉素，請小心操作。

Ø 不要使用過期的試劑盒，不同批號(hào)試劑不能混用。

Ø ELISA 所得的氯霉素濃度若低于該樣品檢品敏感度即可視為該樣品背景值，無須回乘稀

釋倍數(shù)。若所得的氯霉素濃度高于該樣品檢品敏感度，即可能為氯霉素陽性樣品，建議

使用其它檢測方法檢測，如GC/MS 等。

Ø 進(jìn)行生乳的樣本制備時(shí)，在 ELISA 操作時(shí)中充分混勻（操作步驟的第四點(diǎn)）。

Ø 陰性生乳的OD450 吸光值可能會(huì)高于標(biāo)準(zhǔn)品0 ppb 的吸光值但不會(huì)影響對氯霉素陽性

樣本的判定。

7 檢測步驟

7.1 取好所需板條固定于板架后編號(hào)，建議每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測樣本均做復(fù)孔。

7.2 加樣：每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本提取液100μL，然后每孔分別加入氯霉素酶標(biāo)記物

50μL。

7.3 溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于室溫避光反應(yīng)1小時(shí)。

7.4 洗滌：小心揭開封板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入1×洗滌工作液250 μL/孔，充分洗滌3

次，每次間隔小于5 秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。

7.5 顯色：每孔加入底物溶液100μL，輕輕振蕩混勻，室溫下避光靜置20 分鐘。

7.6 測定：每孔加入終止液100μL，輕輕振蕩混勻，5 min 內(nèi)測定450 nm 處吸光度值。

8. 1 計(jì)算B/B0

所獲得的標(biāo)準(zhǔn)品溶液或待測樣本的吸光值（B）除以0 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光值（B0）再乘以*，即為百分吸光值。

百分吸光值（%）= B/B0× *

式中：B — 標(biāo)準(zhǔn)品溶液或待測樣本的吸光值

B0 — 0 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光值

8.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本中氯霉素濃度

以氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為X 軸，對應(yīng)的百分吸光值為Y 軸，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對應(yīng)每一個(gè)樣本的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣本中氯霉素的濃度。

試劑盒靈敏度：0.025 ppb

各樣本zui低檢測限：

生乳、蜂蜜、蜂王漿：0.1 ppb

血清、蛋、魚蝦蟹雞豬肉：0.025 ppb

飼料：0.25ppb

回收率（準(zhǔn)確性）：

生乳（添加0.25 ppb） 70～110%

蜂蜜（添加0.1 ppb） 90～130%

蜂蜜（添加0.3 ppb） 90～130%

蜂王漿（添加0.3 ppb） 80～120%

魚、蝦、蟹、烏賊、雞及豬肉（添加0.1 ppb） 75～125%

魚、蝦、蟹、烏賊、雞及豬肉（添加0.3 ppb） 75～125%

飼料（添加2.0 ppb） 90～130%

血清（添加0.3 ppb） 80～120%

蛋（添加0.3 ppb） 80～120%

精密度：

試劑盒變異系數(shù)小于10%

交叉反應(yīng)率（特異性）：

Chloramphenicol ····························· *

Chloramphenicol（free base） ························ 1.4%

Gentamicin ······························· <0.1%

Thiamphenicol ······························ 3.1%

Tetracycline ······························ <0. 1%

Penicillin ······························· <0.1%

Sulfamethazine ····························· <0.1%

2-8°C 貯存。

未開封試劑盒有效期為12 個(gè)月，開封后3 個(gè)月內(nèi)用完。（見包裝盒上標(biāo)簽有效期）____