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產(chǎn)品分類品牌分類

分子生化產(chǎn)品: 核酸純化 PCR及RT-PCR相關(guān)產(chǎn)品基因組DNA提取 DNA分子量克隆載體及相關(guān)產(chǎn)品感受態(tài)細胞蛋白質(zhì)研究相關(guān)產(chǎn)品電泳相關(guān)產(chǎn)品 OMEGA質(zhì)粒提取

生化試劑產(chǎn)品

細胞生物學(xué)產(chǎn)品: 細胞因子和生長因子重組或天然蛋白

試劑盒產(chǎn)品: 人的ELISA試劑盒

抗體: 二抗一抗

儀器耗材

培養(yǎng)產(chǎn)品: 培養(yǎng)基

細胞庫: 耐藥細胞株人細胞株標(biāo)記細胞株各類原代細胞

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OMEGA/美國
ProSpec
AXYGEN
Abcam
上海淳麥
Invitrogen
Sigma-Aldrich
Roche/羅氏

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供應(yīng)簡介詳細介紹

TUNEL原位檢測試劑盒（冰凍切片）（FITC標(biāo)記POD法）（TdT酶介導(dǎo)的原位末端標(biāo)記dUTP檢測試劑盒）（DNA片段化檢測試劑盒）

Cat number：KGA

Store at-20℃ for one year

Expire date：

For Research Use Only

TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒

（FITC標(biāo)記POD法,冰凍切片）

使用說明書

Cat：KGA7026,7036,7046

（20,50,100Tests）

一、 TUNEL檢測原理 ................................................................................ ..2

二、試劑盒組分 .....................................................................................3

三、檢測樣本的預(yù)處理

1．冰凍切片樣本的預(yù)處理. ........................................................................4

2．陽性對照及陰性對照的準(zhǔn)備 ......................................................................5

四、 標(biāo)記及顯色反應(yīng) ......................................................................6

五、 常見問題的原因及*解決方案 ..............................................................8

一、TUNEL試劑盒說明

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（FITC標(biāo)記POD法）是用來檢測細胞在凋亡過程中細胞核DNA的斷裂情況，其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以連接到凋亡細胞中斷裂的DNA的3^‘－OH末端，可用熒光顯微鏡檢測；熒光素亦可被抗熒光素抗體（anti-fluorescein antibody）標(biāo)記,，在辣根過氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）的存在下，產(chǎn)生很強的顏色反應(yīng)（呈棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細胞，因而在普通光學(xué)顯微鏡下即可觀察和計數(shù)凋亡細胞。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被標(biāo)記或染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟切片）的凋亡原位檢測。

本試劑盒特點

●操作簡便：使用Ready-to-Use型試劑，并配有Proteinase K和DAB。

● 高靈敏度：可以單一檢出初期的凋亡細胞。

● 高特異性：能特異性染色凋亡細胞。

●快速操作：整體操作約需3小時。

● 方便觀察：可使用熒光顯微鏡觀察實驗結(jié)果，亦可在信號轉(zhuǎn)換后使用光學(xué)顯微鏡觀察實驗結(jié)果。

● 高正確性：有陽性對照片的制備方法，可以確認試劑盒的有效性

二、TUNEL試劑盒組分

組份	Cat: KGA-7025 20 assays	Cat: KGA-7035 50 assays	Cat: KGA-7045 100 assays	儲存條件
Equilibration Buffer	1.0 mL	2.5 mL	5.0 mL	-20℃
FITC-12-dUTP	20μL	50μL	100μL	-20℃
TdT Enzyme	80μL	200μL	400μL	-20℃
anti-fluorescein antibody	200μL	500μL	1000μL	-20℃
DAB	2mg	5mg	10 mg	-20℃

*注：因DAB為固體粉末，使用前加入適量PBS溶解，配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按下述方法顯色使用。

注意事項

1．使用前請認真閱讀本說明書，提前準(zhǔn)備好相關(guān)試劑。

2．因本試劑盒中組分均為微量，使用前請離心集液。

3．為避免試驗誤差、降低試劑的損耗，建議使用精密度高的進口微量移液槍及槍頭。

4．TdT 酶反應(yīng)液在使用前根椐樣本數(shù)量集中配制，再分別滴加于各樣本片上，避免每個樣本單獨配制而產(chǎn)生的試劑損耗。

5．用戶自備：多聚甲醛、PBS、H2O2 、TritonX-100、檸檬酸鈉、復(fù)染蘇木素染液、蓋玻片、載玻片、染色缸。

三、檢測樣本的預(yù)處理

TUNEL檢測時樣本的預(yù)處理是試驗的關(guān)鍵所在，本說明書*的條件僅為普遍情況，用戶需根椐自已的樣本材料及*試驗結(jié)果來調(diào)整各個條件（參照Page 7），如處理時間、處理濃度等，來優(yōu)化出適合自身樣本的試驗條件，從而做出客觀的試驗結(jié)果。

1． 冰凍切片的預(yù)處理

2． 陽性對照及陰性對照的準(zhǔn)備

TUNEL檢測同時需要設(shè)陽性和陰性對照，以顯示試驗的客觀性及準(zhǔn)確性。因此需要按下述方法準(zhǔn)備兩個樣本來制備陽性及陰性片，其后續(xù)步驟與待測樣本同樣進行。

A：陽性對照樣本的準(zhǔn)備

組織樣本（冰凍切片）在Triton X-100通透液處理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反應(yīng)液（冰凍切片：2000-3000U DNase I;細胞：1000-2000U DNase I;石蠟切片 3000-5000U DNase I，40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl₂, 10mM CaCl₂）（用戶自備）室溫～37℃處理10～30 min，其余步驟均相同。如有問題詳見Page 7.

B：陰性對照樣本的準(zhǔn)備

在Page6標(biāo)記反應(yīng)制備TdT酶反應(yīng)液時，不添加TdT酶，其余步驟均相同。

四、標(biāo)記和顯色反應(yīng)：

操作注意事項：

1. 進行PBS清洗時，以5分鐘清洗3次為標(biāo)準(zhǔn)。

2. PBS清洗后，為了各種反應(yīng)的有效進行，請盡量除去PBS溶液后再進行下一步反應(yīng)

3. 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應(yīng)液后，請蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進行，這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應(yīng)液干燥造成實驗失敗。

4. TdT酶反應(yīng)液即用即配，短暫于冰上保存。不宜*保存，*保存會導(dǎo)酶活性的失活。

5.如果20×DAB溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。

6.蘇木素復(fù)染：將切片放入蘇木素染液，染色 30s-10min（根據(jù)樣本做適當(dāng)調(diào)整），蒸餾水沖洗干凈后放入鹽酸甲醇溶液中5s，立即用蒸餾水沖洗干凈。分別用70%、85%、95%、無水乙醇浸泡5分鐘。用二甲苯浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘。晾干后在切片上加中性樹膠，加蓋玻片。

現(xiàn)象	可能原因	建議
非特異性染色（例如：非凋亡細胞的強染色）	Biotin-dUTP的非特異性結(jié)合	勿使細胞干涸在TdT酶反應(yīng)之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。
	TdT酶的濃度過高	用TdT dilution buffer* 作1：2—1：10稀釋
	內(nèi)源過氧化物酶未被封閉	封閉液室溫（15-25℃）封閉10min（封閉液： 3%H₂O₂溶于甲醇）
	光照紫外線導(dǎo)致包埋試劑的聚合（如：甲基丙烯酸會導(dǎo)致樣本DNA的斷裂）	嘗試改用其它包埋材料或其它聚合試劑
	在固定組織時樣本DNA已斷裂（內(nèi)源核酸酶的作用）	確保樣品取樣后立即固定或通過肝靜脈灌注固定
	固定后某些核酸酶活性依然較高導(dǎo)致DNA斷裂	用含有dUTP和 dAPT的溶液封閉
染色背景較高	福爾馬林固定導(dǎo)致某些含黑色素前體的細胞染成黃色	嘗試以甲醇固定，但可能會降低檢測的敏感性。
	內(nèi)源過氧化物酶未被封閉	封閉液室溫（15-25℃）封閉10min（封閉液： 3%H₂O₂溶于甲醇）
	Biotin-dUTP的非特異性結(jié)合	在TdT酶反應(yīng)之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。
	樣本被支原體污染	使用支原體檢測試劑盒檢測，如陽性則制備未被污染的新樣本
	標(biāo)記反應(yīng)試劑（TdT酶及dUTP）的濃度過高	稀釋50%，以降低標(biāo)記反應(yīng)的濃度
	細胞處于高度增殖期	在非高增殖期取樣檢測
	DAB孵育時間過長	減少DAB染色時間
標(biāo)記率低、染色淡至無	如果以乙醇或甲醇固定的樣本則標(biāo)記效率較低（因為在固定時染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián)，而在操作中丟失）	用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定或福爾馬林或戊二醛固定。
	過度的固定導(dǎo)致與蛋白過度交聯(lián)	縮短固定時間，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定
	促滲條件不佳，以致于試劑不能到達靶分子或濃度過低	l 增加通透劑促滲時間 l 增加通透劑的作用溫度（15-25℃） l 優(yōu)化蛋白酶K的作用濃度和作用時間（如：以400ug/ml作用5min）

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