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在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V進行熒光素PE標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。可與7-AAD聯(lián)合使用。

本試劑盒可應(yīng)用于培養(yǎng)細胞凋亡檢測（不*用于檢測組織樣本）。

二、試劑盒組份

組份	Cat: KGA1011 10 assays	Cat: KGA1012 20 assays	Cat: KGA1013 50 assays	Cat: KGA1014 100 assays	儲存條件
AnnexinV-PE	10μL	20μL	50μL	100μL	4℃避光
Binding Buffer	5 mL	10.0 mL	25 mL	50 mL	4℃

三、試劑盒以外自備儀器和試劑

流式細胞儀或熒光顯微鏡、低速離心機、微量移液器

1.5m L Microtube、載玻片、蓋玻片（熒光顯微鏡觀察需用）、PBS、不含EDTA的胰酶消化液

四、使用注意事項

1．微量試劑取用前請離心集液。

2． Annexin V-PE避光保存及使用。

3．本試劑盒適用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數(shù)量不以應(yīng)低于1×10⁵^，，不*用于檢測組織樣本。

4． *使用懸浮培養(yǎng)細胞。如果是貼壁細胞，建議適用不含EDTA的胰酶消化，如消化不當(dāng)，可能引起假陽性，而用細胞刮子會造成細胞粘連成團，而影響檢測?？蓪⒁让赶蠹毎谋４嬖诤?/span>2%BSA的PBS中，防止進一步的損傷。

5．細胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅，請不要固定樣品。

6．因檢測細胞的類型、凋亡誘導(dǎo)劑種類、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光補償也不同，因此建議每次檢測均需使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的細胞作為對照，進行熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)。

五、操作方法

1．懸浮細胞離心（2000rpm離心5min）收集；貼壁細胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化時間不易過長，否則容易引起假陽性）；

2．用PBS洗滌細胞二次（2000rpm離心5min）收集1~5×10⁵細胞；

3．加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞；

4．加入1μL Annexin V-PE混勻；

5．室溫、避光、反應(yīng)5～15min；

6．請在1 hour內(nèi)，進行下述熒光顯微鏡或流式細胞儀的觀察和檢測。

A． 熒光顯微鏡觀察

1．滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞；

2．對于貼壁細胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細胞并誘導(dǎo)細胞凋亡；

（1）將細胞于蓋玻片上生長，用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)細胞凋亡，并設(shè)立陰性對照組；

（2）用PBS洗滌細胞兩次；

（3）在500μL 的Binding Buffer中加入1μL Annexin V-PE混勻；

（4）將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋；

（5）避光、室溫反應(yīng)5 min。

3．將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下濾光片（羅丹明）觀察

Annexin V-PE熒光信號呈橙紅色。

B． 流式細胞儀分析

用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm; 發(fā)射波長Em=578 nm。

Annexin V-PE的橙紅色熒光建議使用FL2通道檢測。

熒光補償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。

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