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碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種DNA結(jié)合性染料，其激發(fā)和發(fā)射波長分別為536nm和617nm，產(chǎn)生紅色熒光，但無膜通透性，不能透過活細(xì)胞膜，只能染死細(xì)胞。因此，在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞不能著色，早期凋亡細(xì)胞呈微弱紅光，晚期凋亡細(xì)胞紅光加強(qiáng)，壞死細(xì)胞呈強(qiáng)紅色熒光。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期時，凋亡細(xì)胞因內(nèi)源性核酸酶被激活，使DNA廣泛降解、斷裂，DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生劇變，隨著凋亡的進(jìn)程，DNA斷裂產(chǎn)生的小分子量DNA溢出胞外，細(xì)胞總DNA量降低，于正常G₀/G₁細(xì)胞群前出現(xiàn)一DNA低染細(xì)胞群，即G₁峰前出現(xiàn)亞二倍體峰（sub-G₁）或稱A0細(xì)胞群，即凋亡細(xì)胞群。用本試劑盒的PI直接對細(xì)胞DNA染色后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，即可檢測到凋亡細(xì)胞DNA的變化。

二、試劑盒組份

組分	KGA214（100 assays）	儲存條件
Propidium Iodide, PI染液	500μL	4℃，避光
10×Buffer A	10 mL	4℃

注: 1×Buffer A配制：用前用雙蒸水將10×Buffer A稀釋10倍。

三、試劑盒儀器和試劑

熒光顯微鏡、低速離心機(jī)、微量移液器、1.5m L Microtube、載玻片、蓋玻片、

流式細(xì)胞儀、70%乙醇、RNase A

四、用注意事項(xiàng)

Propidium Iodide （PI）有毒，操作時要戴手套，需避光。

五、操作方法

1．熒光顯微鏡觀察

（1）收集細(xì)胞，1×Buffer A洗滌細(xì)胞一次（離心2000rpm，5min），加適量的

1×Buffer A重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約為10⁶/mL；

（2）取95ul細(xì)胞懸液，加入5 μL PI染液，輕輕混勻；

（3）室溫避光放置5 min后，滴加于載玻片上，加蓋玻片；

（4）熒光顯微鏡，激發(fā)和發(fā)射波長分別為536nm和617nm，綠光*BG12濾光鏡觀察，拍照。

2．流式細(xì)胞儀分析

（1）用1×Buffer A洗滌細(xì)胞一次（離心2000rpm，5min），收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁶/mL；

（2）細(xì)胞加9倍體積的70%乙醇,于-20℃固定至少12小時；

（3）離心收集細(xì)胞后，用1×Buffer A洗細(xì)胞除去乙醇,細(xì)胞重懸于500 μLBuffer A中；

（4）加入RNase A（用戶自備），使其終濃度為0.25mg/ml, 37℃,反應(yīng)30min；

（5）加入5μLPI室溫避光染色30分鐘；

（6）流式細(xì)胞儀或熒光光度計(jì)激發(fā)波長488nm檢測。

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