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形態(tài)學(xué)檢測是研究細(xì)胞凋亡的zui基本方法。細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化是多階段的，起初，細(xì)胞間連接和微絨毛消失，細(xì)胞體積縮小，胞漿凝縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變疏松并與胞膜融合，形成一個(gè)個(gè)空泡，核糖體與線粒體等細(xì)胞器聚集，結(jié)構(gòu)尚無明顯改變，細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)逐漸凝聚成新月狀附在核膜周邊，細(xì)胞核固縮呈均一的致密物，進(jìn)而斷裂成碎塊，此時(shí)細(xì)胞膜仍保持完整：然后，胞膜及核膜不斷出芽、脫落，一個(gè)細(xì)胞變成數(shù)個(gè)大小不等的有膜包裹的凋亡小體：zui后凋亡小體被周圍具有吞噬能力的細(xì)胞吞噬、消化。上述這些形態(tài)學(xué)的變化，可以通過本試劑盒中的染色及光學(xué)顯微鏡觀察。

二、試劑盒組份

組份	KGA220（100 assays）	儲(chǔ)存條件
Dye Reagent 1	10mL	室溫，避光
Dye Reagent 2	1mL	室溫，避光
Buffer A	10mL	室溫

注：Dye Reagent 2使用前，用Buffer A稀釋10倍后染色。

三、試劑盒以外自備儀器和試劑

光學(xué)顯微鏡、低速離心機(jī)、微量移液器、1.5m L Microtube、載玻片、蓋玻片、甲醇、體積分?jǐn)?shù)為1%鹽酸的80%乙醇、無水乙醇、二甲苯、封片樹脂

四、使用注意事項(xiàng)

利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行該項(xiàng)操作時(shí)，不要用血計(jì)板配套的質(zhì)地較硬的蓋玻片，而用普通的蓋玻片反而更利于結(jié)果的觀察。

五、操作方法

1．用適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)細(xì)胞凋亡，消化收集細(xì)胞；

2．用PBS洗滌細(xì)胞二次，并調(diào)成濃度為1×10⁶cells/ml細(xì)胞懸液；

3．吸取50~100μL的細(xì)胞懸液均勻涂布于載玻片（A片）上或用離心涂片機(jī)制片，室溫晾干，甲醇固定5 min；

4．在A片上滴加數(shù)滴100μL的Dyes Reagent 1室溫染色1 min，用水輕輕洗去染液；

5．在含體積分?jǐn)?shù)為1%鹽酸的80%乙醇中分化10 S，流水沖洗1 min，晾干，顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。

6．在另一張涂有細(xì)胞并已于無水乙醇固定2min的載玻片（B片）上滴加100μL染色液2 （Dyes Reagent 2 ：Buffer A=1:9的混合液），室溫染色5～20min，用水輕輕洗去染液，室溫晾干；

7．二甲苯浸泡3 min，以去除雜質(zhì)，使載玻片透明，zui后樹脂封片，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；

8．觀察200-500個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞所占的比例。

結(jié)果分析：

A片：凋亡細(xì)胞皺縮，胞膜完整。染色質(zhì)凝聚，嗜堿性增強(qiáng)，染成深藍(lán)色，呈環(huán)狀或新月狀附在核膜周圍，或細(xì)胞核固縮碎裂成數(shù)個(gè)圓形顆粒，核膜消失。而壞死細(xì)胞體積增大，染色質(zhì)變稀疏成網(wǎng)狀，嗜堿性減低，染成淡藍(lán)色，胞核破碎，細(xì)胞膜不完整。

B片：凋亡細(xì)胞皺縮，胞膜完整。胞漿稀少或缺乏，染成淡紅色，染色質(zhì)凝聚，染成深紫色，細(xì)胞核固縮碎裂成數(shù)個(gè)圓形顆粒。

計(jì)算細(xì)胞凋亡率和死亡率：

細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×*

細(xì)胞死亡率=壞死細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×*

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