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熒光染料Hoechst 33342能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜，使其染上低藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng)，因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33342比正常細(xì)胞的多，熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高，此外，凋亡細(xì)胞的染色體DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結(jié)合，并且凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342排出到細(xì)胞外使之在細(xì)胞內(nèi)積累增加等都使凋亡細(xì)胞的藍(lán)色熒光增強(qiáng)。而PI染料是不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞中，即活細(xì)胞對(duì)PI染料拒染，而壞死細(xì)胞由于膜完整性在早期即已破損，可被PI染料染色。根據(jù)這些特性，用Hoechst 33342結(jié)合PI染料對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染色，就可在流式細(xì)胞儀上將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開來。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，這三群細(xì)胞表現(xiàn)分別為：正常細(xì)胞為低藍(lán)色/低紅色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡細(xì)胞為高藍(lán)色/低紅色（Hoechst 33342++/PI+），壞死細(xì)胞為低藍(lán)色/高紅色（Hoechst 33342+/PI++）。

二、試劑盒組份

組份	KGA212（100 assays）	儲(chǔ)存條件
Heochst 33342 染液	1.0mL	4℃，避光
Propidium Iodide （PI）	500μL	4℃，避光
10×Buffer A	10 mL	4℃

注: Buffer A工作液配制用：雙蒸水將10×Buffer A稀釋10倍。

三、試劑盒以外自備儀器和試劑

熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀、低速離心機(jī)、微量移液器、1.5m L Microtube、載玻片、蓋玻片

四、使用注意事項(xiàng)

1．在紅色熒光對(duì)蘭色熒光散點(diǎn)圖上，還可見到細(xì)胞凋亡區(qū)向細(xì)胞壞死區(qū)遷移的軌跡，可能是凋亡細(xì)胞的DNA進(jìn)一步降解的緣故。
2．用Heochst 33342染料與細(xì)胞孵育的時(shí)間不宜過長，一般控制在20min之內(nèi)為宜。如果太長可引起Heochst 33342的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光的遷移，導(dǎo)致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變，從而影響結(jié)果的判斷。

3．Propidium Iodide （PI）有毒，操作時(shí)要戴手套。

五、操作方法

1．懸浮生長的細(xì)胞離心收集，固定培養(yǎng)的細(xì)胞消化收集后，將10⁵~10⁶個(gè)細(xì)胞懸浮于1mL培養(yǎng)基中，再加入10μL Heochst 33342 染液，混勻，37⁰C孵育5～15 min；
2．細(xì)胞于 4⁰C ，500～1000r/min離心5min棄去上清液；
3．加入1.0mLBuffer A工作液（用雙蒸水將10×Buffer A稀釋10倍）懸浮細(xì)胞，加入5μL PI染液，室溫避光放置5～15min后混勻；
4．熒光顯微鏡觀察：

Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外光，激發(fā)波長為352nm，發(fā)射波長為400～500nm，產(chǎn)生蘭色熒光；PI用氬離子激光激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光。

5．流式細(xì)胞儀分析：

Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外光，激發(fā)波長為352nm，發(fā)射波長為400～500nm，產(chǎn)生蘭色熒光；PI用氬離子激光激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光。分析蘭色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖或地形圖。結(jié)果判斷：在蘭色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖上，結(jié)果為：正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光，凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光，壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光。

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