Thermofisher（Invitrogen）Qubit 4熒光計

尤其適合樣品珍貴、對準(zhǔn)確性要求*的應(yīng)用領(lǐng)域

哪些用戶需要使用Qubit 4 熒光計？

如果您的樣品十分珍貴或用于精密應(yīng)用領(lǐng)域，或者您為了獲得研究結(jié)果進(jìn)行了巨大的投入，那么Invitrogen™ Qubit™ 4 熒光定量計就是您的理想之選。想想下面這些問題：

— 需要快速檢測RNA 樣本的完整性和質(zhì)量？ — 我的樣品十分珍貴而且難以處理嗎？

— 提取后的DNA、RNA 或蛋白質(zhì)量很少嗎？ — 該樣品將被用于成本高昂的下游實驗嗎？

— 我要使用諸如實時定量PCR (qPCR) 或下一代測序方法等需要精密測定的實驗方法嗎？

— 我要進(jìn)行諸如轉(zhuǎn)染等需要幾天甚至幾周才能獲得結(jié)果的實驗嗎？

— 我的樣品制備過程復(fù)雜而且需要諸如激光捕獲顯微切割等特殊技術(shù)嗎？

為什么要使用Qubit 4 熒光計？

Qubit 4 熒光計采用專門研制的熒光檢測技術(shù)和Invitrogen™ Molecular Probes™ 染料。這些染料熒光只有與特異性的靶分子結(jié)合時，才能發(fā)射熒光信號，即使有游離核苷酸或降解核酸存在，這些染料仍能發(fā)揮作用。Qubit 4 熒光定量即便在低濃度下亦具有目前高的DNA 和RNA 定量特異性和靈敏度。

※ 選擇性 — Qubit 熒光定量( 圖1) 采用Qubit 分析試劑盒( 表1)，其包括的染料，只有與DNA、RNA 或蛋白質(zhì)結(jié)合時方可發(fā)出熒光。由于Qubit 技術(shù)只報告靶分子( 而不是雜質(zhì)) 的濃度，因此這種特異性可以使您獲得十分精確的結(jié)果

圖1. Qubit 熒光定量系統(tǒng)。

表1. Qubit 分析試劑盒的分析范圍。

※ 靈敏性 — 僅需1 uL 樣品，能精確可靠地定量濃度僅為10pg/_L 的DNA 和12.5μg/mL 的蛋白質(zhì)樣本

※ 簡單直觀 — 反應(yīng)靈敏的5.7 英寸彩色觸摸屏，直觀的導(dǎo)航按鈕

※ 迅速 — 全新的雙核處理器，5 秒內(nèi)快速計算樣品濃度，多存儲1000 個結(jié)果

※ 個性化 — 個性化設(shè)置常規(guī)應(yīng)用，可通過MyQubit 軟件和網(wǎng)絡(luò)工具創(chuàng)建個性化assay，六國操作語言可供選擇

上市12 年來，Qubit 熒光計一直以其*的準(zhǔn)確度和靈敏性，受到全球上萬個實驗室的青睞。迄今為止，已經(jīng)有17,500 篇有關(guān)Qubit 的文獻(xiàn)引述。新推出的Qubit 4 熒光計秉承上一代儀器的高準(zhǔn)確性，不僅僅可精確測量樣品DNA，RNA 和蛋白質(zhì)含量，還擁有全新的功能，包括：

※ 適用全新RNA IQ assay — 快速可靠地檢測RNA 完整性和質(zhì)量

※ 數(shù)據(jù)導(dǎo)出 — 除U 盤和USB 連接電腦導(dǎo)出數(shù)據(jù)，還擁有WiFi 功能

※ 內(nèi)置試劑計算器 — 快速計算配置工作溶液所需的染料和緩沖液

Qubit 熒光定量的工作流程

Qubit 熒光定量采用熒光染料對目標(biāo)生物分子進(jìn)行定量

采用Qubit 4 熒光計完成的Qubit 分析均采用同一種通用實驗方案。進(jìn)行DNA 和RNA 分析只需混合然后讀數(shù)，孵育時間僅為2 分鐘，蛋白質(zhì)分析孵育時間為15 分鐘( 圖2)，查看Qubit 分析的實驗方案。實驗完成，Qubit 4 熒光計會自動保存您的實驗數(shù)據(jù)，多1000 個。此外，您也可以通過U 盤，USB 數(shù)據(jù)線或WiFi 導(dǎo)出數(shù)據(jù)。

將染料和緩沖液置于室溫下儲存，以獲得佳結(jié)果。DNA、RNA和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品置于4℃儲存。使用前，確保所有分析試劑均在室溫下。

* 除了常用的 dsDNA, oligos, total RNA, microRNA, RNA IQ 和 protein 分析之外，使用Ion Sphere Quality Control Kit，還可用于檢測Ion Sphere Particle 的質(zhì)量，以用于Ion PGM 測序儀。

圖2. 采用Qubit 4 熒光計進(jìn)行Qubit 分析的工作流程。

Qubit 操作簡單直觀

內(nèi)置試劑計算器。 輸入樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量，使用此工具可幫助您快速計算配置工作溶液需要的染料和緩沖液。

Qubit 熒光定量與NanoDrop及其它紫外分光光度計定量方法有何不同？

Thermo ScientificTM NanoDropTM 及其它紫外分光光度計均采用紫外吸光度進(jìn)行檢測，它無法區(qū)分出DNA、RNA、降解核酸、游離核苷酸及其它雜質(zhì)。而Qubit 定量平臺采用熒光染料檢測特異目標(biāo)分子的濃度。

盡管紫外吸收定量法是的一種DNA 或RNA 定量方，但其讀數(shù)并不可靠且不精確(1-4)。紫外吸光度讀數(shù)不加區(qū)別檢測吸光度為260nm 的所有物質(zhì)，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、降解核酸和游離核苷酸。由于Qubit 4 熒光計只檢測目標(biāo)分子，因此其讀數(shù)一般低于A260 讀數(shù)，定量更精確。

此外，分光光度計的靈敏度不足，無法完成低濃度DNA 和RNA的定量。相反，Qubit 4 熒光計能在較低的濃度范圍內(nèi)得出比采用NanoDrop 分光光度計進(jìn)行紫外吸收檢測更準(zhǔn)確、精密的結(jié)果( 圖3)。鑒于上述缺點，使用熒光染料定量核酸已成為一種常見的替代方法[5–8]。

低濃度下的準(zhǔn)確度和精度比較

Qubit 熒光定量能在較低的濃度范圍內(nèi)得出比采用NanoDrop分光光度計進(jìn)行紫外吸光度檢測更準(zhǔn)確、更精密的結(jié)果。采用Qubit dsDNA HS 分析試劑盒及Qubit 熒光計，定量濃度僅為10pg/_L 的樣本中的DNA，測得值在實際值的±12% 范圍內(nèi)( 圖3A)。而采用NanoDrop 分光光度計測量上述相同樣本，測得的濃度比實際值高46 倍。使用Qubit 熒光計檢測低至10 ng/_LDNA 的樣本(NanoDrop 分光光度計的報道下限值為2 ng/_L)，測得值在實際值的±1% 范圍內(nèi)，使用NanoDrop 分光光度計測定的濃度在實際值的±5% 范圍內(nèi)。此外，采用Qubit 熒光計檢測DNA 濃度低至0.5 ng/_L 的樣本，所有樣本的重復(fù)差異(%CV)均_1% ( 圖3B)。而采用NanoDrop 分光光度計檢測，只有DNA濃度為4ng/_L 及以上的樣本的%CV 低于9%。

圖3. Qubit 熒光定量的準(zhǔn)確度和精度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)試劑盒實驗方案，在Qubit 熒光計中采用Qubit dsDNA HS 分析試劑盒重復(fù)10 次測量濃度在0.01至10ng/_L 之間的lambda DNA。同時采用NanoDrop ND-1000 分光光度計重復(fù)10 次測量相同濃度的DNA，比較結(jié)果的準(zhǔn)確度(A) 和精度(B)。準(zhǔn)確度定義為與已知濃度的平均偏差。標(biāo)示的濃度是在Qubit 分析管中稀釋前起始樣本的DNA 濃度。

針對DNA 或RNA 的選擇性比較

采用Qubit 熒光定量和紫外吸光度測量核酸濃度的差異在于Qubit 分析的選擇性，Qubit 分析針對目的分子具有*的特異性，可提供較紫外吸光度更準(zhǔn)確的信息。采用紫外分析時，同時含有DNA 和RNA 的樣本結(jié)果無差別，您無法將它們DNA和RNA 區(qū)分開來。而Qubit 熒光定量能夠準(zhǔn)確測定同一樣本中的DNA 和RNA ( 圖4)。在本實驗中，樣本含有相同含量的DNA和RNA，采用Qubit dsDNA BR 分析試劑盒測得的DNA 濃度在實際含量的±2% 范圍內(nèi)。此外，在RNA 含量較DNA 高10倍的樣本中，采用DNA 分析測得的濃度僅比實際值高7%。而采用NanoDrop 分光光度計進(jìn)行紫外吸光度檢測，無法準(zhǔn)確測量上述樣本中的DNA 和RNA 含量，這增加了后續(xù)實驗中出錯的可能性。

圖4. Qubit 分析與紫外分光光度法相比具有選擇性。采用Qubit dsDNABR 和Qubit RNA BR 分析試劑盒及Qubit 熒光計，按照試劑盒實驗方案檢測含有l(wèi)ambda DNA (10 ng/uL) 和不同量的大腸桿菌核糖體RNA (0-100 ng/uL) 的樣本，每個樣品重復(fù)3 次。然后采用NanoDrop ND-1000分光光度計檢測同一樣本三次，采用PerkinElmer Lambda 35 分光光度計檢測一次。標(biāo)示的濃度是在Qubit 分析管中稀釋前起始樣本的DNA和RNA 濃度。紅色和橙色趨勢線分別表示起始樣本中DNA 和RNA 的實際含量。( 分別) 稀釋純的濃縮DNA 和RNA 溶液，采用PerkinElmer Lambda 35 分光光度計測定260 nm 處的光密度，使稀釋后溶液的光密度值為1.0，設(shè)定核酸的實際濃度。然后計算儲液濃度，用于后續(xù)稀釋。采用紫外分析時，同時含有DNA 和RNA 的樣本結(jié)果無差別- 您無法將它們區(qū)分開來。

靈敏度和范圍比較

采用Qubit 熒光計及Qubit 分析試劑盒的靈敏度高于紫外吸光度檢測，由于該分析能夠檢測1–20uL 的樣本，因此分析的有效范圍進(jìn)一步擴大。Qubit dsDNA HS 和BR 分析試劑盒覆蓋的樣本濃度范圍為10 pg/uL 至1 ug/uL DNA。據(jù)制造商報道，NanoDrop 分光光度計覆蓋的樣本濃度范圍為2 ng/uL 至15 ug/uL，由此可見，Qubit 適合的濃度范圍更寬，不過，高濃度樣本在分光光度計上測定就不必稀釋。

如何創(chuàng)建個性化的分析應(yīng)用？

熒光計模式

選擇熒光計模式，Qubit 4 熒光計就可以被用做小型的熒光計。在熒光計模式里，不同于使用分析試劑盒時的校準(zhǔn)和基于算法的計算結(jié)果，儀器直接產(chǎn)生并顯示每個樣本的原始熒光數(shù)據(jù)(RFU)。熒光計模式允許您可以手動選擇發(fā)射光源：藍(lán)色LED ( 大~470nm) 或紅色LED ( 大~635 nm)。如果選擇藍(lán)光發(fā)射，儀器讀取綠色或遠(yuǎn)紅外通道的熒光；如果選擇紅光發(fā)射，則僅讀取遠(yuǎn)紅外通道的熒光。

通過熒光計模式收集的數(shù)據(jù)可以用于設(shè)計您的個性化assay 配合MyQubit 創(chuàng)建新的分析類型。

MyQubit- 為Qubit 4 熒光計設(shè)計和創(chuàng)建新的分析類型

Qubit 4 熒光計與MyQubit assay 設(shè)計工具兼容。您只需在此在線工具上輸入您的assay 參數(shù)，保存并上傳.qbt 文件至您的Qubit 4 熒光計，即可運行您的個性化分析，拓展Qubit 的應(yīng)用范圍。

* 目前，我們已開發(fā)6 個新的分析( 膽guchun、葡萄糖、半乳糖、guan酸、過氧化氫、蔗糖分析)，如有需要可直接下載上傳至您的Qubit。

Thermofisher（Invitrogen）Qubit 4熒光計儀器參數(shù)：

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