使用化學限定培養(yǎng)基來控制質(zhì)量穩(wěn)定性和降低生產(chǎn)成本是目前大部分生物制藥企業(yè)所追求的，但是有一些細胞的培養(yǎng)還是離不開在培養(yǎng)基中添加血清。本研究發(fā)現(xiàn)，不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的血清，使用Rebel儀器仍然能獲得準確的氨基酸代謝趨勢數(shù)據(jù)。

一、       比較基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基與添加了10%胎牛血清的成分濃度差異

背景：DMEM、IMDM和RPMI是細胞培養(yǎng)過程中使用的三種最常見的細胞培養(yǎng)基配方。這些化學定義的培養(yǎng)基是無蛋白質(zhì)，含有氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和其他成分的特定配方，以適應細胞系的營養(yǎng)需求。對于某些類型的細胞培養(yǎng)和過程（例如，干細胞、T和B細胞、成纖維細胞、雜交瘤細胞、HEK293細胞、白血病細胞、植物細胞、昆蟲細胞等），這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基通常添加10% v/v的胎牛血清（FBS）。胎牛血清的添加補充了維持細胞活力和生長所必需的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和生長因子，并使培養(yǎng)物適應pH值、溫度、滲透壓或其他培養(yǎng)動態(tài)的變化。然而，添加胎牛血清的培養(yǎng)基對傳統(tǒng)色譜方法具有挑戰(zhàn)性。血清蛋白會干擾色譜法。用蛋白質(zhì)沉淀制備樣品可能會干擾培養(yǎng)基組分的回收率，導致新鮮培養(yǎng)基或反應液的結(jié)果有偏倚。

實驗：一種不含谷氨酰胺和細胞培養(yǎng)級胎牛血清（美國來源）的DMEM、IMDM和RPMI培養(yǎng)基按以下方法進行了測試。所有的培養(yǎng)基樣品都按照制造商的說明進行處理。最終溶液稀釋10倍后，沒有額外的樣品制備。

添加和不添加10%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基成分濃度。誤差條來自于5次重復的標準偏差。

結(jié)論：當比較添加和不添加胎牛血清補充劑的標準基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分時，每種培養(yǎng)基的培養(yǎng)基成分水平幾乎沒有差異。對于DMEM培養(yǎng)基，不添加胎牛血清的配方非常相似，在實驗誤差范圍內(nèi)。然而，補充10%的血清后均檢測到低水平的Ala、Glu和Pro。這三種氨基酸在DMEM配方中不存在，因此補充胎牛血清后的結(jié)果表明這些成分的添加量非常低。有和無血清的IMDM培養(yǎng)基均無明顯變化。RPMI培養(yǎng)基在配方中不含Ala，但在10%胎牛血清補充樣品中檢測到Ala。與DMEM的結(jié)果一樣，這表明從胎牛血清中添加的少量Ala足夠多，可以在補充血清的培養(yǎng)基樣本中檢測到。使用REBEL，人們可以在血清添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方時常規(guī)監(jiān)測培養(yǎng)基成分的這些輕微變化。這種做法可以支持多種細胞系的培養(yǎng)過程和培養(yǎng)基準備。

二、比較添加不同量的胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基的成分濃度差異

背景：RPMI培養(yǎng)基是常用的化學定義和無蛋白的細胞培養(yǎng)基之一，因為它適用于多種哺乳動物細胞系（如干細胞、T和B細胞、雜交瘤、HEK293、THP-1白血病細胞等）。RPMI培養(yǎng)基中通常添加1-10%水平的胎牛血清（FBS），以補充維持特定細胞系過程所必需的生長因子。然而，當需要對培養(yǎng)基進行常規(guī)的定量分析時，F(xiàn)BS補充的培養(yǎng)基就會出現(xiàn)一些問題。混合培養(yǎng)基中高血清蛋白含量可能會干擾氨基酸分析的標準色譜柱。在用傳統(tǒng)的色譜平臺進行分析之前，可能需要用沉淀法去除蛋白質(zhì)來制備樣品。這種額外的樣品準備可能會影響氨基酸回收率，導致傳統(tǒng)的介質(zhì)分析方法的偏倚結(jié)果。

實驗：將市售的RPMI培養(yǎng)基（不含谷氨酰胺）和細胞培養(yǎng)級胎牛血清（美國來源）混合在以下水平上。所有的培養(yǎng)基樣品都按照制造商的說明進行處理。最終溶液在用REBEL進行分析前稀釋10倍，沒有額外的樣品制備。

添加胎牛血清的RPMI和RPMI的培養(yǎng)基成分濃度。誤差條來自于6次重復的標準偏差。

結(jié)論：該分析能夠在單一稀釋水平上定量24種不同的培養(yǎng)基組分，包括19種氨基酸。在堿性RPMI培養(yǎng)基和添加高達10%胎牛血清的RPMI樣品之間，培養(yǎng)基成分的濃度幾乎沒有差異。Ala和Gln例外。Ala和Gln都不在RPMI的原始配方中。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基和1%胎牛血清補充的培養(yǎng)基中均未檢測到。然而，在5%和10%的胎牛血清中，Ala和Gln都被鑒定出來，這與在稀釋10倍后的純血清中檢測這兩種氨基酸的單獨觀察結(jié)果一致（未顯示）。與配方相對應，精氨酸在所有氨基酸里濃度最高，平均為2.108 mM。相比之下，色氨酸的濃度較低，平均為0.011 mM。使用Rebel，可以快速和自信地篩選補充血清的培養(yǎng)基配方，以確保在引入細胞培養(yǎng)基之前批量培養(yǎng)基的一致性。

三、比較添加不同量的胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基的成分濃度差異

背景：IMDM是杜DMEM的一種氨基酸、維生素和無機鹽富集版本。IMDM通常用于成纖維細胞樣細胞系（如COS-7）、造血干細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞（如Jurkat細胞）的高密度細胞培養(yǎng)。由于IMDM是一種化學定義的培養(yǎng)基，它缺乏生長因子、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。為了支持細胞生長，IMDM通常補充胎牛血清（FBS）（如1-10%），這取決于細胞系。當使用化學定義的細胞培養(yǎng)基，如IMDM補充胎牛血清，培養(yǎng)基分析可能是一個負擔。在用標準色譜柱添加的胎牛血清中高水平的蛋白質(zhì)之間出現(xiàn)干擾?？赡苄枰~外的樣品制備來去除和沉淀樣品介質(zhì)中的蛋白質(zhì)。這些增加的步驟可能會影響微量介質(zhì)成分（如氨基酸和維生素）的回收率，導致介質(zhì)分析的傳統(tǒng)分析方法的問題。

實驗：不含谷氨酰胺的商業(yè)IMDM培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)級胎牛血清（美國來源）按以下水平混合。所有的培養(yǎng)基樣品都按照制造商的說明進行處理。最終溶液在用Rebel進行分析前稀釋20倍，沒有額外的樣品制備。

添加胎牛血清的IMDM和IMDM的培養(yǎng)基成分濃度。誤差條來自于6次重復的標準偏差。

結(jié)論：用Rebel稀釋劑單次稀釋20倍后，分析結(jié)果能夠定量24種不同的培養(yǎng)基成分，包括18種氨基酸和3種B族維生素。在單獨添加堿性IMDM培養(yǎng)基和添加高達10%胎牛血清的IMDM樣品之間，培養(yǎng)基成分的濃度幾乎沒有差異。在這些氨基酸中，色氨酸的平均濃度較低，平均為0.032 mM，賴氨酸的平均濃度最高，為1.165 mM。維生素B1（硫胺素）是所有培養(yǎng)基成分中檢測到的較低濃度，平均濃度為0.004 mM。GABA和βAla并不普遍存在于所有化學定義的培養(yǎng)基配方中，兩者在所有樣品的平均濃度分別為0.028 mM和0.030 mM。有了REBEL，可以快速地篩選添加血清的培養(yǎng)基配方。

四、Sf9和Sf21昆蟲細胞培養(yǎng)基中必需氨基酸含量的比較

背景：Sf9和Sf21等昆蟲細胞系最初是從果蛾中分離出來的。它們通常用于重組蛋白表達、疫苗開發(fā)和病毒載體生產(chǎn)。這些細胞系非常適應貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)，以及傳統(tǒng)的血清培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基和無蛋白培養(yǎng)基。選擇合適的培養(yǎng)基是基于多種條件的，但其中最重要的就是氨基酸含量。許多氨基酸不是由昆蟲細胞合成的，有些氨基酸對于添加到細胞培養(yǎng)基中以獲得最佳的生長和/或蛋白質(zhì)生產(chǎn)是至關(guān)重要的。了解昆蟲細胞代謝，并了解細胞培養(yǎng)基中氨基酸的含量，可以采用更明智的過程開發(fā)分析策略，將細胞生長/活力和生產(chǎn)力的變化與培養(yǎng)基中的營養(yǎng)含量聯(lián)系起來。

實驗：本研究使用了三種不同的細胞培養(yǎng)基，分別用于Sf9或Sf21昆蟲細胞系的生長。測試的昆蟲細胞培養(yǎng)基包括傳統(tǒng)培養(yǎng)基、化學定義的培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基樣品均按照制造商的說明進行處理。樣品在REBEL分析前稀釋100倍，沒有額外的樣品制備。為簡單起見，只顯示了三種培養(yǎng)基的必需氨基酸進行比較。

來自傳統(tǒng)、化學定義和無血清昆蟲培養(yǎng)基的必需氨基酸圖譜。誤差條來自于5次重復的標準偏差

結(jié)論：所有必需氨基酸的含量都不同。與化學定義的和無血清培養(yǎng)基相比，傳統(tǒng)培養(yǎng)基的His水平明顯高7.4倍和11.3倍。然而，傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的五種氨基酸水平低——Ile、Leu、Met、Phe和Val?；瘜W定義的培養(yǎng)基中Ile、Lys、Met、Phe、Trp和Val的水平最高。此外，它與無血清培養(yǎng)基的高水平并列。除了Leu，無血清培養(yǎng)基中所顯示的其他必需氨基酸的第二或第三多。這一簡短的分析說明了考慮測量昆蟲細胞培養(yǎng)基中氨基酸的組成是如何至關(guān)重要的。

使用方法和樣品處理：

你所看到的就是你所得到的。

REBEL側(cè)面不需要外部計算機、壓縮氣瓶、廢物或者試劑瓶。

您需要做的只是，取品(1)后離心或過濾以除去細胞，并用REBEL稀釋液(2)稀釋。然后將樣品載入設備(3)，按“start"(4)。所有的校準劑和試劑都放在REBEL儀器內(nèi)部，數(shù)據(jù)將被自動處理成報告（CSV或PDF），可用U盤導出(5)。