用于顯微鏡觀察的標(biāo)本

用于顯微鏡觀察的標(biāo)本必經(jīng)經(jīng)過(guò)一定的準(zhǔn)備過(guò)程才能在顯微鏡下形成清晰的像。在入射照明和透射照明中，對(duì)于標(biāo)本的光學(xué)要求有很大區(qū)別，在入射照明中傷是由標(biāo)本的反射光所形成的；相反，在進(jìn)射照明中保是由透射光所形成的，在這種情況下反射光對(duì)于像的形成不僅無(wú)益，而且會(huì)降低像的清晰度。

用入射光觀察的標(biāo)本，它的準(zhǔn)備工作十分簡(jiǎn)單，只是清潔標(biāo)本的表面并切割為適當(dāng)大小的小塊。而用透射光觀察的標(biāo)本，必須具有由于光吸收的差異而產(chǎn)生的一定反差，才能在顯微鏡下被觀察到。為此，標(biāo)本必須經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的處理和制備過(guò)程，這種制備技術(shù)就是我們一般所說(shuō)的生物顯微技術(shù)。

從光學(xué)觀點(diǎn)出發(fā)，對(duì)于用透射光觀察的顯微鏡標(biāo)本有如下要求：

（1）適當(dāng)?shù)暮穸取＿@種厚度在較好的光學(xué)系統(tǒng)中能夠達(dá)到盡可能高的分辨力，且與這個(gè)系統(tǒng)的場(chǎng)探相適應(yīng)。

（2）足夠的透明度。

（3）能夠形成建立在吸收差異上的足夠的反差。

實(shí)際上所有的生物學(xué)材料通過(guò)石措包埋、切片（或涂片）、貼附、溶蠟、透明等過(guò)程，能夠得到在厚度和透明度上符各要求的標(biāo)本，然后通過(guò)染色程序得到一定程度的反差。

通常在透射式光學(xué)顯微鏡中所使用的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)組織切片，它的厚度一般為3—7μm。在這個(gè)厚度范圍內(nèi)，當(dāng)使用低倍物鏡（例如10×）觀察時(shí)，場(chǎng)深對(duì)于觀察整個(gè)切片厚度是*足夠的；當(dāng)使用高信物鏡（例如100×）觀察時(shí)，場(chǎng)深僅僅是這個(gè)切片厚度的很小部分（圖4．8），不斷地從上到下移動(dòng)細(xì)調(diào)可以得到切片的總體印象。因此，5—7μm厚的常規(guī)切片可以被認(rèn)為是在低放大倍數(shù)和高放大倍數(shù)理想情況之間的調(diào)和，兩者都較好地考慮到了場(chǎng)深和分辨力。同時(shí)由于種種原因，這種調(diào)和的厚度也滿(mǎn)足了實(shí)際工作中的許多要求，首先物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)不總是*直要的；其次在很?。?—2μm）的切片中生物標(biāo)本中的立體關(guān)系就看不到了；與此相反，當(dāng)使用8—10μm或者更厚的切片時(shí)，除了分辨力上可覺(jué)察的損失而外，還會(huì)引起生物標(biāo)本中不同層次的互相重疊。

經(jīng)過(guò)固定、包埋、切片、溶蠟、透明等處理之后的動(dòng)植物材料標(biāo)本是足夠薄和透明的了，但是反差很小，并且這種反差主要來(lái)自于折射和衍射。顯然，這種標(biāo)本在反差上是遠(yuǎn)不理想的。但是這可以通過(guò)降低折射效果給它覆蓋上“吸收物質(zhì)”，并通過(guò)吸收的差異而增大反差。在標(biāo)本與周?chē)鷧^(qū)域之間的折射，可以通過(guò)把標(biāo)本封藏在加拿大樹(shù)被或其他人工合成的封藏介質(zhì)中的方法而減小。所有這些封藏介質(zhì)經(jīng)過(guò)揮發(fā)或聚合使其變硬之后，它們的折射率就接近被固定或被脫水的動(dòng)植物組織主要成分的折射率。在大多數(shù)動(dòng)植物組織中這個(gè)數(shù)值為1.5l--1.54。同時(shí)用這個(gè)方法還可以消除蓋玻片下面的反射引起的閃光。

已經(jīng)應(yīng)用了一個(gè)多世紀(jì)，并且能夠給顯微鏡標(biāo)本帶來(lái)較好反差的zui有效方法是染色。一般沒(méi)有染色的生物標(biāo)本，特別是當(dāng)放置在具有與生物標(biāo)本相近折射率的介質(zhì)中時(shí)，像的反差是很小的。在染色的標(biāo)本中，像的反差的增大是建立在染料選擇性分布的基礎(chǔ)上。染色與未染色標(biāo)本在反差上有巨大差異。

生物切片經(jīng)常粘貼在具有26×76mm標(biāo)準(zhǔn)尺寸和1．1—1．3mm厚度的裁玻片上，裁成片的兩面應(yīng)是平行平面。對(duì)于裁濃件厚度的要求不是很?chē)?yán)格的，但是當(dāng)它的厚度超過(guò)一些較高矯正程度集光器的自由工作距離時(shí)，裁玻片厚度對(duì)于聚焦光源以及在物體平面上形成祝場(chǎng)光闌的像就變得重要了。對(duì)于這種情況，厚度為0.9—1.0mm的裁玻片是比較合適的。至于蓋玻片在第三章中已講過(guò)了，這里不再重復(fù)。

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