Multi-Attribute Method(MAM)是基于質譜的一種自動化分析方法，可以實現(xiàn)在生物制品研發(fā)和生產過程中，用質譜方法一次進樣同時監(jiān)測多個產品質量屬性（PQA），從而將質譜這一傳統(tǒng)意義上用于研發(fā)的分析技術，應用于產品放行。如何可信地表征生物制品的關鍵質量屬性（PQA）一直是生物制藥企業(yè)MAM技術的核心問題?；谂鲎舱T導解離（CID）的MAM工作流程通常需要結合互補的MS/MS技術用于鑒定氨基酸同分異構體等PQA。傳統(tǒng)的ExD碎裂受限于過長的循環(huán)時間和低靈敏度，無法在單針進樣的情況下實現(xiàn)相關PQA的MAM分析流程，而基于全新電子活化解離（EAD）的MAM技術，單針進樣即可準確，快速，靈敏且可重現(xiàn)地分析生物制品的PQA，如氨基酸同分異構體等。
多質量屬性監(jiān)測MAM：
MAM是一種功能強大的LC-MS方法，用于同時監(jiān)測和量化生物制品的多個產品質量屬性（PQA）或關鍵質量屬性（CQA）。傳統(tǒng)意義上，基于CID的MS/MS被用作鑒定的第一步，然后使用基于MS或MS和MS/MS工作流進行量化。然而，基于CID的MS/MS方法不可能對發(fā)生脫酰胺化的肽段進行全序列確認，包括區(qū)分亮氨酸與異亮氨酸、天冬氨酸與異天冬氨酸（Asp vs. isoAsp）以及脆弱修飾（如糖基化）的定位。因此，基于CID的鑒定工作流程必須依賴于互補的MS/MS技術，在對所選物種進行量化之前，在單獨的實驗中使用其他更先進的儀器。我們可以使用基于EAD的平臺方法5,6解決這一挑戰(zhàn)，該方法能夠在單針進樣中使用MAM對PQA進行可靠、準確的識別、量化和監(jiān)測（圖1）。
圖1：基于EAD的MAM工作流程。ZenoTOF 7600系統(tǒng)提供的EAD平臺方法1-4為序列確認和翻譯后修飾（PTM）的識別提供了可靠的肽圖結果，并能夠區(qū)氨基酸分異構體。這是MAM獲得這些PQA和CQA準確量化結果的先決條件。用于肽圖分析的Biologics Explorer軟件和用于PQA和CQA量化的符合合規(guī)要求的SCIEX OS軟件的結合，使基于EAD的MAM工作流成為一個簡化的單針進樣過程。
基于EAD的MAM工作流的主要特點：
1
可靠的PQA識別和氨基酸異構體區(qū)分：單針進樣的EAD平臺方法可以區(qū)分氨基酸異構體和翻譯后修飾（PTM），這對傳統(tǒng)表征和MAM方法具有挑戰(zhàn)性。
2
簡化的數(shù)據流：可定制的PQA列表將Biologics Explorer軟件中的肽圖結果與符合合規(guī)性要求的SCIEX OS軟件將PQA量化和監(jiān)測關聯(lián)起來。
3
強大的肽圖軟件：Biologics Explorer軟件為肽圖分析和PQA選擇提供了強大的算法和優(yōu)化的工作流。
4
合規(guī)性：PQA量化和監(jiān)控。
MAM流程概述：
圖2：Biologics Explorer軟件結合合規(guī)軟件SCIEX OS的MAM工作流。在此流程中，使用Biologics Explorer軟件從EAD DDA數(shù)據的肽圖中非?？尚诺卮_定了mAb的PQA。選擇感興趣的PQA并將其導出到.txt文件，然后導入到使用SCIEX OS軟件的分析模塊創(chuàng)建的處理方法中。峰面積積分使用MQ4算法執(zhí)行，然后創(chuàng)建用于相對PQA量化和監(jiān)測的自定義模板。報告功能提供了許多用于自定義和選擇不同文件格式的選項，例如word文檔和pdf文檔。
PQA的監(jiān)控：
分析模塊提供了充分的靈活性，可以在處理方法中構建自定義公式，用于計算PQA的豐度百分比7-8。圖3顯示了VVSV肽段PQA的量化結果，該結果是通過將帶有自定義公式的處理方法應用于NISTmAb對照品的3次重復進樣，并持續(xù)給予加熱壓力而獲得?？紤]到定量結果的嚴格性，計算的百分比豐度在CID和EAD方法中均具有高度的重現(xiàn)性（%CV<10%）。
圖3：SCIEX OS軟件的分析模塊對PQA的相對定量結果，圖標列出了以NISTmAb為對照，熱壓情況下三次進樣VVSV肽段的異構化和脫酰胺化峰面積的豐度百分比。
從0天到10天持續(xù)給與加熱壓力，脫酰胺化程度Asp和不同isoAsp形式的百分比值顯著增加。為了快速檢查結果，SCIEX OS軟件提供了用于可視化的度量圖（圖4A），或者可以使用其他繪圖選項在Excel中導出和處理結果（圖4B）。
圖4：MAM的可視化結果。圖（A）和圖（B）都展示了重復進樣的PQA量化的重現(xiàn)性，以及MAM工作流監(jiān)測PQA豐度百分比的能力，以用于不同時間節(jié)點研究。
總結：
1.PQA的可靠識別及氨基酸異構體的明確區(qū)分對于MAM的成功實施至關重要。
2.通過基于EAD碎裂的DDA采集方法，可以區(qū)分脫酰胺作用中的Asp和isoAsp異構體，脫酰胺化是PQA的一個重要類別，可能影響藥物的療效和安全性。
3.通過現(xiàn)成的工作流程模板，Biologics Explorer軟件實現(xiàn)了高效識別，該模板提供了可靠的肽圖結果和可視化工具，能夠將PQA列表導出到SCIEX OS軟件進行量化。
4.符合法規(guī)要求的SCIEX OS軟件為PQA的峰提取和相對定量提供了強大的算法和工具。
5.通過Biologics Explorer軟件和合規(guī)的SCIEX OS軟件之間的數(shù)據流，實現(xiàn)了從識別到量化的有效MAM工作流。
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