散射光靈敏度：采用已知大小的校準微球檢測儀器的FSC和SSC。在散射光FSC/SSC散點圖上，應檢測出直徑0.5mm 或更小的微球，或滿足儀器出廠聲明的要求。

熒光靈敏度：流式細胞儀能檢測到標準熒光微球上的最少熒光分子數， 可用MESF表示，常用熒光通道應為FITC≤ 200 MESF、PE≤100 MESF 、APC≤200 MESF，或滿足儀器出廠聲明的要求。

以8峰微球檢測MESF舉例，每個熒光通道獲取8峰微球的MFI，根據微球說明書提供的軟件，計算相對應熒光通道的MESF。

散射光分辨率：采用EDTA鹽或肝素抗凝全血，取適量樣品稀釋后直接上機測定，標本在FSC/SSC散點圖可將紅細胞和血小板清晰地區(qū)分開；取適量樣品裂解紅細胞后上機測定，標本在FSC/SSC散點圖可將淋巴細胞、單核細胞、粒細胞清晰地區(qū)分開，即認為散射光分辨率符合要求。

熒光通道分辨率：采用校準微球上機測定，各熒光通道的分辨率CV值應符合制造商聲明的要求。

可采用含有不同熒光強度的校準微球（已知其相應熒光素的MESF）進行檢測，計算每 一種熒光微球的MFI，以MEFL數（y）和平均熒光強度（x）的線性回歸，計算相關系數（r）。相關系數r應≥0.98，此方法適用于校準微球上的熒光素可被定量檢測的熒光通道。

以FITC/PE通道8峰微球舉例

將標準微球充分混勻后上機進行試驗，測試完成后利用直方圖分析實驗結果，計算標準微球的平均熒光強度FL1，連續(xù)8小時開機后，再通道條件下重復檢測，得到標準微球的平均熒光強度FL2，根據兩次檢測結果計算偏差，公式見下，每一通道的平均熒光強度變化范圍均應在基線值±10%范圍內。

使用濃度為5000個/µL～10000個/µL的校準微球上機進行測定，獲取至少100000個顆粒，連續(xù)測定3 次，計算檢測通道內設定區(qū)域的顆粒數，分別記為H1、H2、H3；再使用空白溶液上機測定，獲取顆粒30s，連續(xù)測試3次，計算該檢測通道內設定區(qū)域的顆粒數，分別記為L1、L2、L3。按照此步驟重復循環(huán)3 次。

取上述公式計算最大值。攜帶污染率應≤0.5％。

批內精密度：選取至少5個新鮮全血樣品，樣品的淋巴細胞亞群細胞計數應覆蓋低中高水平。每個標品從熒光染 色到上機檢測重復3次，并確保所有測試都在同一臺儀器的同一批內測定，整個操作過程由同一個操作 人員完成。先計算每個樣品重復3次后檢測結果的CV,然后計算所有樣品的平均CV，所有樣品的平均CV 宜＜10％，最大不超過20％。實驗室可根據不同水平的淋巴細胞亞群細胞計數設定不同程度的可接受CV 標準。

日間精密度：宜使用正常和異常兩個濃度水平的全血質控品，每天從熒光染色到上機測定重復操作3次， 至少重 復4天，整個操作過程可由不同操作人員完成。先計算每天每個全血質控品重復3次檢測結果的CV值，然 后據此計算每個全血質控品4天的平均CV，最后得出兩個全血質控品檢測結果的平均CV。判定標準同上。

樣品穩(wěn)定性：驗證樣品在確定的抗凝及處置條件下的穩(wěn)定性。采集健康人或患者的樣品至少 5 份，即刻染色-裂 解-固定并上機測定，以此結果作為基線參考水平，按照實驗室的具體環(huán)境溫度控制條件和預期的樣品待檢時間，在抗凝劑保存時間內，設置不同的時間點對上述樣品進行重復處理和上機測定，獲取檢測結果，并與基線水平結果進行比較，以相對偏差或絕對偏差表示，檢測結果應符合實驗室制定的驗證要求。淋巴細胞亞群計數過低者，宜以絕對偏差進行驗證；亦可對試劑說明書聲明的穩(wěn)定性條件進行驗證。

處理后標本穩(wěn)定性：旨在明確處理后標本的最長待檢時間。采集健康人或患者的樣品至少5份，對完成染色-裂解-固定 后的標本即刻上機檢測結果作為基線水平。按實驗室獲得檢測結果的最長可接受時間為期限，設置不同 的時間點對固定后標本進行上機檢測。結果判定同上一條。亦可對試劑說明書聲明的穩(wěn) 定性條件進行驗證。

適用于淋巴細胞亞群絕對細胞計數。根據試劑說明書聲明的線性范圍，取一份淋巴細胞計數或亞群 計數接近線性范圍上限的臨床樣品，采用樣品稀釋液按照比例制備 5～9 個不同濃度的標本，濃度范圍應覆蓋臨床醫(yī)學決定水平；通過染色-裂解-固定后，上機測定， 每個標本重復測定 4 次，取均值。分析實際測定的亞群細胞數量均值與理論值之間的相關性，相關系數 r 應≥0.975。

抗體試劑批次變更前后的可比性驗證：宜使用至少3份健康人的新鮮全血樣品和2份不同濃度質控品，采用新批號抗體試劑和當前批號抗體 試劑進行熒光染色、上機檢測，以當前批號試劑檢測結果為參考，計算相對偏差或絕對偏差。檢測結果 應符合實驗室制定的驗證要求。驗證要求的制定應考慮不同水平的淋巴細胞亞群計數設定不同程度的偏 差值，淋巴細胞亞群計數過低者，宜以絕對偏差進行驗證。

不同檢測系統間的可比性驗證：宜使用至少 5 份新鮮全血樣品（樣品的淋巴細胞亞群細胞計數應覆蓋低中高水平）和 2 份不同濃度 水平的全血質控品，完成染色-裂解-固定后，分別采用待評價檢測系統和比對檢測系統進行檢測。比對 檢測系統應為儀器性能良好、規(guī)范開展室內質量控制、室間質量評價成績合格的淋巴細胞亞群常規(guī)檢測 系統，以比對檢測系統的測定結果為參考，計算相對偏差或絕對偏差。檢測結果應符合實驗室制定的驗 證要求。驗證要求的制定應考慮不同水平的淋巴細胞亞群計數設定不同程度的偏差值，淋巴細胞亞群計 數過低者，宜以絕對偏差進行驗證。

不同檢測人員間的可比性驗證：宜使用至少5份新鮮全血樣品和2份不同濃度水平的全血質控品，分別由實驗室內淋巴細胞亞群檢測 培訓合格的不同檢測人員完成染色-裂解-固定、上機檢測和數據分析，計算不同檢測人員間檢測結果的 相對偏差或絕對偏差。驗證結果應符合實驗室制定的驗證要求。

可使用室間質評回報結果驗證淋巴細胞亞群項目的準確度。

應選擇商品化全血質控品進行室內質控，并至少包括兩個濃度水平，CD4+T細胞的絕對細胞計數應包括低值濃度水平質控。

檢測當日至少做一次質控，質控品應和患者樣品同時進行免疫熒光染色，并在患者標本檢測前進行上機測定和數據分析。檢測完成后做好相應質控記錄。

應至少選擇1_3S和2_2S作為失控判斷標準，應有相應的失控糾正措施。

以CD3+T細胞質控曲線舉例

隨著TBNK項目開展的普及，結果的準確與患者免疫狀態(tài)的評估和治療方案的制訂是否能夠正常進行的前提與保障。因此TBNK室內質控尤為重要，可以確保TBNK檢測結果的準確性和可靠性。