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小鼠白介素-6ELISA試劑盒檢測過程
閱讀：1486 發(fā)布時間：2013-3-13 規(guī)格96T
前言簡介
白介素6是一種細胞因子,已被證實為B細胞分化因子.它是一種抗體形成系統(tǒng),它的生理特性,如肝細胞急性蛋白合成的誘導(dǎo)和基于和白介素3協(xié)同作用的生長激等,也備受關(guān)注. 并且已證實白介素-6與病理學(xué)存在穩(wěn)定的相關(guān)關(guān)系.例如,報道多種疾病的生長因子為白介素-6, 骨髓瘤細胞能合成白介素-6并表達白介素-6受體.此外, 白介素6在多種炎性疾病和自身免疫疾病發(fā)揮重要的作用. 此試劑盒能高靈敏度的檢測小鼠血清和細胞基質(zhì)上清的白介素6 原理 此試劑盒運用了兩種特異性抗體,洗板后加入TMB底物液顯色,顯色的強度與小鼠的白介素-6的量成正比. 檢測范圍 10.94 700 pg/mL
預(yù)期用途
■此IBL試劑盒能用于小鼠血清,EDTA血漿,細胞上清中白介素-6的定量檢測
試劑盒成分
1 預(yù)包被板: 抗小鼠白介素-6兔子IgG,親合純化 96T
2 酶標記抗體: （30倍濃縮）HRP標記抗小鼠白介素-6兔子IgG,親合純化 0.4mL x 1
3 標準品: 重組小鼠白介素-6 0.5mL x 2
4 EIA緩沖液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 30mL x 1
5 標記抗體稀釋液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 12mL x 1
6 顯色劑: TMB底物液 15mL x 1
7 終止液: 1N硫酸 12mL x 1
8 濃縮洗滌液: （40倍濃縮） 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 50mL x 1 操作說明 1實驗所需器材（但試劑盒沒有提供） 酶標儀（450nm） 微移液管及其吸嘴 量筒及燒杯 去離子水 冰箱（4°C） 坐標紙（log/log） 吸水紙 試管（用于標準品稀釋） 溫育箱（37°C ± 1°C） 洗瓶 （用于洗板） 一次性試劑管（用于濃縮酶標記抗體和顯色劑）
2準備
1） 洗滌液的準備 試劑盒的洗滌液是一種40倍濃縮液,用1950 mL去離子水稀釋50 mL的濃縮洗滌液,制成2000mL即用稀釋洗滌液. 置于冰箱內(nèi)可保存2周.
2） 酶標記抗體的準備 試劑盒中的標記抗體是一種30倍濃縮物,根據(jù)所需量,用標記抗體稀釋液稀釋30倍. 示例: 如果你用一條板（8孔）,就需800 μL.的標記抗體.就用870 μL的標記抗體稀釋液稀釋30 μL抗體濃縮液,充分混勻.并每孔各加100 μL 濃縮酶標記抗體需稀釋后才能用于實驗 剩余的稀釋標記抗體液需密封瓶裝,存于4°C
3） 標準品的準備 加0.5 mL的去離子水到瓶裝標準品,制成濃度為1,400 pg/mL小鼠白介素-6標準品液
4） 標準品的稀釋 準備8支試管,并每支各加230 μL EIA緩沖液.稀釋成如下濃度,
步驟如下圖所示: 試管1 700 pg/mL 試管2 350 pg/mL 試管3 175 pg/ mL 試管4 87.5 pg/mL 試管5 43.75 pg/mL 試管6 21.88 pg/mL 試管7 10.94pg/mL 試管8 0 pg/mL（樣品空白對照） 吸取230ul的標準品液于1號管混勻然后從1號管吸取230ul加入2號管混勻如下圖所示,按此規(guī)律稀釋系列標準品濃度范圍為10.94-700 pg/mL,第8號管為0 pg/mL作為樣品空白對照
5） 樣品稀釋 樣品如需稀釋時,必須用EIA緩沖液進行稀釋 如果樣品中小鼠白介素-6的濃度范圍一無所知的話,預(yù)先準備幾個不同稀釋濃度的樣品液來確定*的檢測濃度.
3實驗步驟 使用前將所有試劑應(yīng)平衡至室溫大約30min充分混勻確保試劑質(zhì)量無改變標準曲線和樣品檢測必須同時進行. 試劑 待檢測樣品 標準品 樣品空白 試劑空白 檢 測 樣 品100ul 稀釋標準品1-7管100ul EIA緩沖液第8管 100ul EIA緩沖液100ul 蓋板于4°C下溫育過夜 洗板7次 酶標抗體 100ul 100ul 100ul - 蓋板于4°C下溫育30min 洗板9次 顯色劑 100ul 100ul 100ul 100ul 室溫避光溫育30min 終止液 100ul 100ul 100ul 100ul 加終止液后,30min內(nèi)于450nm處讀取OD值
1 設(shè)試劑空白對照并于相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液
2 確定好樣品空白對照孔檢測樣品孔和標準品孔分別將100ul樣品對照品（8號管）、檢測樣品和稀釋好的標準品（1-7號管）加入到相應(yīng)的微孔中。
3 蓋板4°C下溫育過夜
4 用洗滌瓶劇烈洗板,再加入稀釋洗滌液,靜置15-30秒,再*倒去孔內(nèi)反應(yīng)液 重復(fù)洗板7次. zui后在吸水紙上拍干,去除殘留液滴 如用自動洗板機洗板,先自動洗4次,再按上述用洗瓶手工洗3次
5 除試劑空白對照孔外,其余每孔各加100ul酶標抗體
6 蓋板4°C下溫育30min
7 按照上述步驟4洗板9次
8 用一次性試管取所需量的顯色劑各加100ul顯色劑于微孔中.為了避免污染勿將剩余試劑在倒回試劑瓶中
9 室溫避光溫育30min加入顯色劑后溶液顏色會變成藍色
10每孔各加100ul終止液溶液顏色會變成黃色
11擦去微孔板底部的污跡或水滴確保微孔內(nèi)溶液無氣泡產(chǎn)生.加入終止液后30min內(nèi)于酶標儀 450nm處讀取結(jié)果 特別注意
1） 收集樣品后即盡快檢測. 如需保存, 凍存樣品,但要避免反復(fù)凍融.檢測前,將樣品解凍至室溫
2） 如樣品需稀釋,用EIA緩沖液稀釋
3） 樣品和標準品建議做雙份檢測
4） 保持樣品處于中性PH范圍.有機溶劑的污染會影響實驗結(jié)果
5） 只能用本試劑盒提供的洗滌液洗板.不充足的洗板會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果 6） 在吸水紙上拍干去除殘留液滴時,切勿用吸水紙刮擦孔內(nèi)壁
7） 顯示劑應(yīng)避光保存并避免與金屬物質(zhì)接觸
8） 加終止液后,30 min內(nèi)就應(yīng)讀取實驗結(jié)果
結(jié)果計算 所有實驗數(shù)據(jù)（包括標準品,檢測樣品的OD值）,都應(yīng)減去樣品空白對照的OD值. 在log-log坐標紙用,以較正的OD值為縱坐標,相對應(yīng)的濃度為橫坐標,建立標準曲線. 樣品直接在標準曲線上獲取濃度值.
每次實驗都應(yīng)建立其標準曲線. 使用及處理常規(guī)事項
1所有試劑置于2 - 8°C保存.實驗前將試劑平衡至室溫（約30分鐘）
2瓶裝標準品是凍干品,故小心打開瓶蓋
3終止液是強酸物質(zhì).使用時,避免其接觸皮膚和衣膚
4棄置用過的物質(zhì)前,用水沖洗
5 濃縮酶標抗體,EIA緩沖液和濃縮洗滌液可能會出現(xiàn)沉淀,但這并不會影響實驗
6使用試劑后應(yīng)洗手
7切勿混用不同批號的試劑
8別使用過期的試劑
9試劑盒僅供研究用,不能用于臨床診斷 存儲與有效期 存儲條件: 2 - 8°C 有效期見試劑盒外包裝
本譯文僅供參考詳情請以原文為準。