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一氧化氮合酶染色法的具體操作步驟

    一氧化氮合酶（nitrfic oxides synthase，NGS）是一種連接酶，能催化前體物質(zhì)L精氨酸L瓜氨酸和一氧化氮（NO）。NO是中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的一種神經(jīng)遞質(zhì)，活細胞間信使和內(nèi)皮源性松弛血管的介質(zhì)，在神經(jīng)、心血管及免疫系統(tǒng)中有廣泛的作用。NO極不穩(wěn)定。易于擴散游離，半衰期短，不易檢測。因NOS是合成NO的關(guān)鍵酶，故通常通過檢測NOS的活性來評估NO的分布和功能。NOS有3種異構(gòu)型，即神經(jīng)型NOS（neuronal NOS，nNOS）、內(nèi)皮型NOS（endothelial NOS。eNOS）和細胞因子誘導(dǎo)型NOS（inducible NOS，iNOS）。由于還原型輔酶Ⅱ—黃遞酶（NADPH-d）與NOS在化學(xué)結(jié)構(gòu)和組織定位上有*的一致性，且也與NO密切相關(guān)．故人們常采用NADPH-黃遞酶法來顯示NOS活性。
 
    1．原理  在βNADPH存在下，NOS的C末端能將NADPH電子轉(zhuǎn)移到NBT，將NBT還原成不溶性藍紫色甲臘沉淀產(chǎn)物。
 
    2．孵育液配制
    β—NADPH                   10mg
    NBT                        5mg
    Triton X—100              0．03ml
    0．05mol/L TB（pH 8．0）     9．97ml
    臨用前配制。
 
    3．染色程序
    （1）固定：4％多聚甲醛（0．1mol/LPBS配制）灌流固定，取材后入同樣固定液再固定1小時（4℃），20％蔗糖中4℃過一夜；
    （2）冰凍切片：厚10—401．Lm；
    （3）孵育：切片人孵育液中37％孵育30分鐘～1小時；
    （4）終止反應(yīng)：切片人0．05mol/LTB或蒸餾水中；分鐘；
    （5）常規(guī)脫水、透明、封片或直接用甘油明膠封片。
 
    4．結(jié)果與評價  反應(yīng)產(chǎn)物為藍色或藍紫色沉淀。NADPH-黃遞酶法顯示NOS活性，方法簡便經(jīng)濟，應(yīng)用廣泛，但不能區(qū)分NOS亞型。
 
    5．對照實驗  在孵育液中除去β—NADPH或用0．1mol/L N—亞硝基精氨酸（NOS抑制劑）預(yù)孵育切片1小時，結(jié)果應(yīng)為陰性。

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