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引物純化方式有哪些,如何選擇?
閱讀：4037 發(fā)布時(shí)間：2021-7-131.脫鹽
寡核苷酸合成后，為了純化寡核苷酸成為天然的DNA結(jié)構(gòu)，首先必須去除保護(hù)基團(tuán)。通過(guò)濃氨水處理，合成的寡核苷酸從固相載體上分離，2-氰乙氧基--磷酸二脂鍵的保護(hù)基團(tuán)，以及堿基的保護(hù)基團(tuán)基（苯甲?；彤惗』┍蝗コ瑥亩纬闪颂烊坏腄NA結(jié)構(gòu)。然而，必要的去保護(hù)步驟完成后，寡核苷酸混合物還包含幾種必須被去除的小分子有機(jī)化合物。所有非必須有機(jī)化合物被移除的過(guò)程通常叫做脫鹽。脫鹽純化可以借助反向硅膠柱進(jìn)行。盡管脫鹽純化可以移除所有的非必須有機(jī)雜質(zhì)，但它不能有效移除合成中產(chǎn)生微量的提前終止的寡核苷酸雜鏈。然而，脫鹽的寡核苷酸還是能夠滿(mǎn)足ＰＣＲ檢測(cè)等基礎(chǔ)生物研究。
2.BioRP / OPC純化
如果寡核苷酸以“三苯甲基”的形式合成，則N-甲基寡核苷酸包含5’-DMT基團(tuán)，提前終止的寡核苷酸不包含該基團(tuán)。因?yàn)镈MT基有強(qiáng)的親脂的特性，有5’-DMT基團(tuán)的寡核苷酸與反相樹(shù)脂有親和性，因此反相親和樹(shù)脂通常被用于寡核苷酸的純化。利用反向樹(shù)脂和5’－DMT寡核苷酸存在強(qiáng)親和力，但是提前終止的寡核苷酸不包含DMT基團(tuán)，所以，我們能夠成功的把想要的N-甲基寡核苷酸從提前終止的寡核苷酸雜質(zhì)中分離出來(lái)。
3.HPLC
如果合成的寡核苷酸應(yīng)用于克隆，定向誘變或定量的基因探測(cè)，那么對(duì)其純度要求較高。脫鹽或OPC純化的寡核苷酸可能達(dá)不到要求，則HPLC純化被廣泛地用于這個(gè)目的。作為一種純化樹(shù)脂，陰離子交換樹(shù)脂或反向樹(shù)脂被用于寡核苷酸純化。陰離子交換樹(shù)脂的HPLC通常顯示95-98%純化效率，對(duì)于達(dá)到35-mer寡核苷酸的純化是充分的。反向樹(shù)脂化的HPLC與陰離子交換樹(shù)脂的HPLC呈現(xiàn)相似的純化效率。因?yàn)镠PLC的純化效率很大程度依靠寡核苷酸的長(zhǎng)度，用HPLC法不能有效純化長(zhǎng)的寡核苷酸（大于35-mer)。
4.PAGE
對(duì)于長(zhǎng)的寡核苷酸的純化（50-100mer），我們推薦PAGE純化法，它使用交連的聚丙烯酰胺凝膠(電泳)作為純化基質(zhì)。盡管PAGE顯示出高的純化效率（＞98%），但它在額外的步驟方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脫鹽，繼而將導(dǎo)致純化產(chǎn)率的下降。
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