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免疫熒光細胞化學(xué)技術(shù)
閱讀：2363 發(fā)布時間：2012-9-14
免疫熒光細胞化學(xué)技術(shù)
免疫熒光細胞化學(xué)是現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一，是由Coons等（1950）建立，經(jīng)過近43年的發(fā)展，免疫熒光技術(shù)與形態(tài)學(xué)技術(shù)相結(jié)合發(fā)展成免疫熒光細胞（或組織）化學(xué)。它與親合化學(xué)技術(shù)如葡萄球菌A蛋白（SPA）、生物素與卵白素、植物血凝素（ConA等）相結(jié)合拓寬了領(lǐng)域；與激光技術(shù)、電子計算機和掃描電視等技術(shù)結(jié)合發(fā)展為定量免疫熒光細胞化學(xué)技術(shù)；熒光激活細胞分類器（FACS）的應(yīng)用使免疫熒光細胞化學(xué)技術(shù)發(fā)展到更高的階段，開創(chuàng)了免疫熒光技術(shù)的新領(lǐng)域。細胞顯微分光光度計與與圖像分析儀的結(jié)合使免疫熒光組織化學(xué)的定量檢測更加準確。在免疫熒光細胞化學(xué)中應(yīng)用單克隆抗體日益增多，將會不斷提高特異性、敏感性和應(yīng)用范圍。激光掃描等聚集顯微鏡的應(yīng)用又開創(chuàng)了新的發(fā)展時代。
由于免疫熒光細胞化學(xué)的特異性，快速性和在細胞和分子水平定位的敏感性與準確性，在免疫學(xué)、微生物學(xué)、細胞和組織學(xué)、病理學(xué)、腫瘤學(xué)以及臨床檢驗學(xué)等生物學(xué)和醫(yī)學(xué)許多方面得到廣泛應(yīng)用，日益發(fā)揮重要的作用。
*節(jié) 免疫熒光細胞化學(xué)的原理
免疫熒光細胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量（圖3-1）。
圖3-1 紫外光激發(fā)熒光物質(zhì)放射熒光示意圖
用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。
免疫熒光細胞化學(xué)分直接法、夾心法、間接法和補體法。
一、直接法
1．檢查抗原法 這是zui早的方法，用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，直接與細胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法很特異和簡便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差（圖3-2）。
圖3-2 直接法
2．檢查抗體法 將抗原標記上熒光素，即為熒光抗原，用此熒光抗原與細胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗體反應(yīng)，而將抗體定位檢測出來。
二、間接法
1．檢查抗體法（夾心法） 此法是先用特異性抗原與細胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。
2．檢查抗體法 用已知抗原細胞或組織標本的切片，加上待檢血清，如果其中含有切片中某種抗原的抗體，抗體便沉淀結(jié)合在抗原上，再用間接熒光抗體（抗種屬特異性IgG熒光抗體）與結(jié)合在抗原上的抗體反應(yīng)（如檢測人血清中的抗體必需用抗人IgG熒光抗體等），在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應(yīng)部位呈現(xiàn)明亮的特異性熒光。此法是檢驗血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段（圖3-3）
圖3-3 間接法
3．檢查抗原法雙薄片 此法是直接法的重要改進，先用特異性（對細胞或組織內(nèi)抗原）抗體（或稱*抗體）與細胞標本反應(yīng)，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體（也稱第二抗體，種特異性）與結(jié)合在抗原上的抗體（是第二抗體的抗原）結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復(fù)合物。由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗全顯著多于直接法，從而提高了敏感性。如細胞抗原上每個分子結(jié)合3～5個分子抗體，當此抗體作為抗原時又可結(jié)合3～5分子的熒光抗體，所以和直接法相比熒光亮度可增強3至4倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種*抗體的標記顯示。這是現(xiàn)在zui廣泛應(yīng)用的技術(shù)。
三、補體法
1．直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物法 用抗補體C3等熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補體反應(yīng)，而形成抗原抗體補體復(fù)合物---抗補體熒光抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部位就是免疫復(fù)合物的存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等。
圖3-4 補體法
2．間接檢查組織內(nèi)抗原法 常將新鮮補體與*抗體混合同時加在抗原標本切片上，經(jīng)37℃孵育后，如發(fā)生抗原補體抗體反應(yīng)，補體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補體熒光抗體與結(jié)合的補體反應(yīng)，形成抗原抗體—抗補體熒光抗體的復(fù)合物，此法優(yōu)點是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的*抗體的標記顯示。
四、雙重免疫熒光標記法
在同一細胞組織標本上需要同時檢查兩種抗原時，要進行雙重熒光染色，一般均采用直接法，將兩種熒光抗體（如抗A和抗B）以適當比例混合，加在標本上孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標記，發(fā)黃綠色熒光；抗B抗體用TMRITC或RB200標記，發(fā)紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。
五、對照試驗
為了保證免疫熒光細胞化學(xué)染色的準確性，排除某些非特異性染色，必須在初次試驗時進行以上對照試驗：
1．直接法 需設(shè)下述對照試驗
?。?）標本自發(fā)熒光對照：標本只加PBS或不加PBS，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察應(yīng)呈陰性熒光（無與特異性熒光相似的熒光）。
?。?）抑制試驗：可分為二步法和一步法。
①二步抑制法：標本先加未標記的特異性抗體，再加標記熒光抗體，結(jié)果應(yīng)呈陰性或明顯減弱的熒光。
②一步抑制法：先將熒光抗體用未標記抗體作適量混合，再加在標本上染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。此法效果較二步法好，并且簡便。
?。?）陽性對照：用已知陽性標本作直接法免疫熒光染色，結(jié)果應(yīng)呈陽性熒光。
如對照（1）和（2）無熒光或弱熒光，（3）和待檢查標本呈強熒光即為特異性陽性熒光。
2．間接法
?。?）自發(fā)熒光對照：同上（一）。
?。?）熒光抗體對照：標本只加間接熒光抗體染色，結(jié)果陰性。
?。?）抑制試驗：同上。
?。?）陽性對照：同上。
如對照（1）、（2）、（3）均呈陰性，陽性對照和待檢標本陽性則為特異性熒光。
3．補體法
?。?）自發(fā)熒光對照
?。?）熒光抗體對照
?。?）抑制試驗
?。?）補體對照：取新鮮豚鼠血清1：10稀釋先作用標本，再用抗補體熒光抗體染色，結(jié)果陰性。
?。?）抑制試驗：標本加滅活的*抗體，再用1：10稀釋度的新鮮豚鼠血清孵育后，再加未標記的抗補體血清與抗補體熒光抗體等量混合稀釋液，結(jié)果應(yīng)為陰性。
（6）陽性對照：（1）～（5）結(jié)果陰性，（6）和待檢標本陽性時，則為特異性熒光。
第二節(jié) 熒光抗體的制備
熒光抗體是免疫熒光細胞化學(xué)的重要技術(shù)之一，制備高特異性和價的熒光抗體必須選用高質(zhì)量的熒光素和高特異性價的免疫血清。
一、熒光素
熒光是指一個分子或原子吸收了給予的能量后即刻引起發(fā)光，停止能量供給，發(fā)光也瞬時停止（一般持續(xù)10-7～10-8s）?？梢援a(chǎn)生明亮熒光的染料物質(zhì)，稱熒光色素。目前主要常用的熒光色素有以下3種：
?。ㄒ唬┊惲蚯杷釤晒馑兀‵luorescein isothiocyanate, GITC）
呈黃色、橙黃或褐黃色粉末或結(jié)晶，性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫下能保存2年以上，在低溫中可保存多年。易溶于水和酒精。zui大吸收光譜為490～495nm，zui大發(fā)射光譜為520～530nm，呈現(xiàn)黃綠色熒光，分子量為398.4（圖3-5）。
在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，成為標記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。反應(yīng)式如下（圖3-6）：
一個Ig分子上zui多能 標記15～20個FITC分子。
圖3-5 FITC的吸收光譜和發(fā)射光譜
圖3-6 抗體的FITC標記反應(yīng)式
（二）四乙基羅達明（tetraethylrodamine B200, RB200）
呈褐紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。zui大吸收光譜為570nm，zui大發(fā)射光譜為595～600nm,呈明亮橙紅色熒光。分子量為580（圖3-7）。
RB200在五氯化磷（PCl5）作用下轉(zhuǎn)變成磺酰氯（SO2Cl），在堿性條件下易與蛋白質(zhì)的賴氨酸ε-氨基反應(yīng)結(jié)合而標記在蛋白分子上?；瘜W(xué)反應(yīng)式如下（圖3-8）。
圖3-7 RB200在可見光區(qū)的吸收 圖3－8 RB200標記抗體反應(yīng)
光譜和熒光光譜
圖3-8 RB200標記抗體反應(yīng)
?。ㄈ┧募谆惲蚯杷崃_達明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC）
它是一種紫紅色粉末，較穩(wěn)定。其zui大吸收光譜為550nm，zui大發(fā)射光譜620nm，呈橙紅色熒光，與FITC的黃綠色熒光對比清晰（圖3-9），與蛋白質(zhì)結(jié)合方式同TITC。它可用于雙標記示蹤研究?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式如下（圖3-10）。
圖3-9 TMRITC在可見光區(qū)的吸收
光譜和發(fā)射光譜
圖3-10 TMRITC結(jié)構(gòu)式
[NextPage]
二、熒光素標記抗體的方法
（一）FITC標記抗體的方法
1．Marsshall 氏法
?。?）材料：抗體球蛋白溶液、0.5mol/l pH9.0碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1%硫柳汞水溶液、三角燒瓶（25～50ml）、冰及冰槽（或1000ml燒杯）、電磁攪拌器、滅菌吸管、透析袋、玻棒、棉線及燒杯（500ml）、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等。
?。?）方法及步驟：
?、倏贵w的準備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使zui后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度適當以不起泡沫為宜）5～10min。
②熒光素的準備：根據(jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克蛋白加0.01mg 熒光素，用分析天平準確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。
?、劢Y(jié)合（或稱標記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完），加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右，故須及時添冰去水；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中。
?、芡肝觯航Y(jié)合完畢后，將球蛋白的溶液離心（2500r/min）20min，除去其中少量之沉淀物，裝入透析袋中后再置于燒杯中，用pH8.0緩沖鹽水透析（0～4℃）過夜。
?、葸^柱：取透析過夜的標記物，過葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光抗體進行鑒定（圖3-11，圖-3-12）。
圖3-11 Sephadex G-25 對FITC
圖3-12 FITC與家兔IgG球蛋白在25℃和2℃時結(jié)合的動力學(xué)（Kawamura 1964）
洗脫液：0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）;過濾量:12ml標記蛋白液（過濾前未透析）;收集量:20ml（稀釋1.7倍）。
分別以1mgFITC溶于2份1mol 0.5mol/L碳酸重碳酸鹽緩沖液（分別為pH9.5和pH9.0），于2℃下攪拌將其各加入100mg家兔IgG生理鹽水溶液中，攪勻后立即將每份分為兩半。一半保留于2℃下，另一半置25℃下。間隔一定時間后各取出0.5ml通過sephadex G-25去游離FITC，由上計算出5mg家兔IgG結(jié)合的FITC量。
2．Chadwick 氏法
?。?）材料：抗原球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%重碳酸鈉水溶液、0.01mol/l Ph8.0磷酸鹽緩沖鹽水、1%硫柳汞、離心機及離心管、三角燒瓶（25ml）、冰槽、無菌吸管及毛細滴管、燒杯（500ml）、透析袋、棉線、玻棒等。
?。?）方法及步驟：
?、倏贵w準備：用0～4℃pH8.0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg/ml，置入三角燒瓶內(nèi)，放于冰槽中。
?、跓晒馍販蕚洌喊疵亢量说鞍准尤霟晒馑?.01mg計算，稱取所需之熒光素量，用3%重碳酸鈉水溶液溶解。
?、蹖蕚渲贵w與熒光色素溶液等量混合，充分攪勻，在0～4℃，冰箱中結(jié)合18～24h。
④透析和柱層析：方法同Marshall 氏法。
3．改良法（1963年） 根據(jù)Marshall 氏法取高價的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水（0.15mol/l NaCl）及緩沖液（0.15mol/l NaHCO3 –Na2CO3 PH9.0） 稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白10mg,緩沖液為總量的10%，降溫至4℃，加入異硫氰酸鹽熒光素，（蛋白：熒光素=50～80mg:1mg），在0～4℃下電磁攪拌12～14h。然后用半飽和和硫酸銨將標記球蛋白沉淀分離，除去未結(jié)合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨（用Nessler氏試劑測驗至隔夜透析之鹽水無氨離子及熒光色素為止）。將制備好的熒光抗體加疊氮鈉0.01%,分裝在1ml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，-20℃保存可達2年以上。
【附一】0.01mol/L pH7.2 PBS 配法：NaCl 18g 、Na2HPO41.5g、KH2PO40.2g,溶于2000ml蒸餾水中，校定pH至7.2。
【附二】0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液配法：取0.5mol/l Na2CO3（5.3%）10ml加入0.5mol/l NaHCO3（4.2%）90ml,混合后，校定pH至9.0。
【附三】3%重碳酸鈉水溶液配法：稱1.5g無水重碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。
4．透析標記法 此法適用于小量抗體的熒光素標記，標記簡便，非特異性染色較少。
?。?）用0.025mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0，將欲標記免疫球蛋白稀釋成1%濃度，裝入透析袋中。
?。?）用同一緩沖液將FITC配成0.1mg/ml的溶液，按1%球蛋白液體積的10倍，將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內(nèi)，并使透析袋浸沒于FITC液中。容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4℃電磁攪拌下，透析標記24h。取出透析袋中標記液，即刻用sephadex G-50 凝膠過濾，去除游離熒光素，分裝、貯存于4℃中（圖3-13）。
圖3-13 標記抗體溶液通過sephadex 產(chǎn)膠柱層析分布
?。ǘ┧囊一_達明標記抗體方法
取1g RB200及PCL52g放在乳缽中研磨5min（在通風(fēng)櫥中）。然后加入10ml無水丙酮，放置5min，不斷攪拌。過濾，用濾液進行標記抗體。剩余部分吸附在濾紙上，4℃干燥保存。
取抗體（20mg/ml）每毫升加入生理鹽水和0.5mol/l pH9.0的碳酸鹽緩沖液各1ml稀釋。逐滴加入0.1ml RB200溶液，邊加入邊攪拌，在0～4℃中結(jié)合12～18h，再用生理鹽水透析5～7h，經(jīng)葡聚糖凝膠G-50柱層析，除去游離熒光素，分裝，貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
?。ㄈ┧募谆惲蚯杷崃_達明標記抗體方法
?。?）Igg 10ml （6mg/ml）在0.01mol/l pH9.5碳酸鹽緩沖液中透析過夜。
?。?）將四甲基異硫近氰酸羅達明（每毫克IgG加入5～20μg）溶于二甲亞砜（1mg/ml）,取此溶液300μl，一滴一滴加入蛋白質(zhì)溶液中，同時電磁攪拌。
?。?）在室溫中攪拌2h，避光。
?。?）把結(jié)合物移入直徑3cm,高30cm大小的Bio –Gel P-6層析柱（用0.01mol/l pH8.0的PBS平衡過），流速為1.5ml/min。
（5）收集先流出的紅色結(jié)合物，即為標記抗體，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
（四）藻紅蛋白標記抗體的方法
1．巰基化藻紅蛋白（phycoerthrin PE）的制備，600μl的15.5mg/ml鹽酸巰醇亞胺（iminothiolane hydrochloride）加到1.2ml的3.6mg/ml的PE中，和1.2ml PB、pH6.8 混合，裝入透析袋置入50mmol/l pH6.8 PB中透析，4℃過夜，再換用pH7.5PB透析6h。每個PE分子中可結(jié)合8個巰基。
2．PE-IgG制備 異雙功能試劑SPDP[n - Succ - inimdyl 3-（2-pyridyldlthio） propinate ] 30μl （1.1mg/ml）的乙醇溶液，加入700μl的4.2mg/ml IgG PB溶液（50mmol/l pH7.5），在室溫中反應(yīng)2.5h。再加入巰基化Pe 400μl（1.7mg/ml）加到500μl反應(yīng)混合液中，室溫反應(yīng)12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸鈉封閉殘余巰基，用PB透析過夜，4℃。加入0.01%Na3N3分裝，4℃保存半年。
?。ㄎ澹㏄E-標記蛋白A方法
?。?）取4.08mg PE溶于0.1mol/l pH7.4PB（含0.1mol/l NaCl）1ml中，溶解后，取出0.5ml，再加入10μlSPDP無水甲醇液（2.65mg/ml）,SPDP/蛋白摩爾比為10，22℃反應(yīng)5min，過Sephadex G-50（1×17cm）,用100mmol/l pH7.4 PBS（含0.1mol/l NaCl）平衡和洗脫。
?。?）0.5ml蛋白（2mg/ml）100mmol/l PB（含有100mmol/l NaCl） pH7.4，加入2.6μl上述SPDP甲醇液，SPDP：蛋白=9.5,22℃,40min ,加入25μmol/L二硫蘇糖醇（DTT）pH7.4緩沖液，22℃，25min，同上過Sephadex G-50，收集蛋白A峰。
?。?）取0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，22℃反應(yīng)6h，混合物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
以上兩種PE標記制品，可zui后溶于0.01mol/l pH7.4PB（含有0.1mol/l DETA、1mol/L碘乙酰胺、1%BSA 和0.1%NaN3）,0～5℃保存。
（六）藍色熒光素標記抗體方法
Kbaffan等（1986）首先創(chuàng)立了藍色熒光素標記和染色技術(shù)，可進行雙標記或多標記。
?。?）取7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methyl coumarin, AMC）260μg溶于二甲亞砜25μl中。
（2）將上液加入10ml IgG的 巴比妥緩沖液（0.5mol/L,pH8.5,內(nèi)含50～100mg IgG）中，室溫反應(yīng)2h，過Sephadex G-50除去游離熒光素。
AMC呈黃色結(jié)晶固體，zui大吸收波長354nm,zui大熒光波長430nm。
三、熒光抗體質(zhì)量控制
對制備的熒光抗體必須進行質(zhì)量鑒定，主要進行特異性和敏感性兩個方面的鑒定。
?。ㄒ唬┤旧禺愋院兔舾行缘臏y定
1．特異性染色效價的測定 直接染色以倍比稀釋熒光抗體溶液如1：2，1：4，1：8……，與相應(yīng)抗原標本作一系列染色，熒光強度在“+++”的zui大釋釋度，即為該熒光抗體的染色滴度（效價）或單位。實際染色應(yīng)用時，可取低一個或兩個稀釋度（即2～4個單位），如染色效價為1：64，實際應(yīng)用時可取1：32或1：16。間接染色效價可按抗核抗體熒光染色法步驟，先用不同稀釋度的熒光抗體染色，結(jié)果以抗核抗體熒光強度“++”為標準，染色用效價和直接法相同。
2．非特異性染色測定 根據(jù)熒光抗體的用途不同，可用相類似的抗原切片或涂片，倍比稀釋熒光抗體，按常規(guī)染色，結(jié)果在標本上出現(xiàn)的非特異染色應(yīng)顯著低于特異染色滴度，否則應(yīng)采取消除非特異性染色的方法處理熒光抗體。
3．吸收試驗 在熒光抗體中加入過量相應(yīng)抗原，于室溫中攪拌2h后，移入4℃中過夜，3000r/min,離心30min，收集上清液，再用以染相應(yīng)抗原陽性標本，結(jié)果應(yīng)不出現(xiàn)明顯陽性熒光。
4．抑制試驗如前述。
?。ǘ〧/P比值的測定
F（熒光素）和P（抗體蛋白）的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量，一般要求F/P的克分子比值為1～2。過高時，非特異性染色增強；過低時，熒光很弱，降低敏感性。
1．蛋白質(zhì)定量 測定熒光抗體的蛋白質(zhì)mg/ml量。
2．結(jié)合熒光素定量 先制作熒光素定量標準曲線，即準確稱取FITC1mg,溶于10ml 0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液中，再用0.01mol/l pH7.2PBS稀釋到100ml，此時熒光素含量為10 μg/ml，以此為原液，再倍比稀釋9個不同濃度的溶液，用分光光度計在490nm波長測定光密度值（OD），以光密度為縱坐標，熒光素含量為橫坐標，作標準函數(shù)圖。
熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其吸收光譜峰值向長波方向位移約5nm,FITC和蛋白質(zhì)結(jié)合后由490nm變?yōu)?93～495nm，RB200和蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)?95nm。
F/P比值的計算：可按以下公式計算。
式中160000為抗體蛋白質(zhì)的分子量，390為FITC的分子量。蛋白質(zhì)從克換算為毫克需再乘以103，而熒光素從克換算為微克需要再乘以106。
測定RB200熒光抗體的克分子比值公式如下：
按圖3-4測定法更為簡便，即先用276nm波長測得蛋白質(zhì)的OD值，再用493波長測得FITC的OD值，將這兩個OD值在圖3-14上連成一直線，直線與各縱線交叉處，即可查出標記抗體的以下數(shù)值：FITc μg/ml ，F(xiàn)/P 的μg/mg,F/P的克分子比值，蛋白mg/ml等。
圖3-14 FITC標記物中球蛋白、熒光色素和E/P比值計算圖
四、熒光抗體的保存
以0～4℃或-20℃低溫保存，防止抗體活性降低和蛋白變性。加入濃度為1：5000～10000的硫柳汞或1：1000～5000的疊氮鈉防腐，小量分裝如0.1～1ml，真空干燥后更易長期保存。
[NextPage] 第三節(jié) 免疫熒光細胞化學(xué)染色方法
一、標本制作
可制作涂片、印片、細胞單層培養(yǎng)物、組織切片，經(jīng)適當固定或不固定，作免疫熒光染色用。
二、熒光抗體染色方法
?。ㄒ唬┲苯臃?/p>
1．染色 切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等），在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。
2．洗片 傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結(jié)晶。
3．用50%緩沖（0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0～9.5）甘油封固、鏡檢
4．對照染色
?、僬Ｃ鉄晒庋迦旧?，如上法處理切片，結(jié)果應(yīng)為陰性。②染色抑制試驗（一步法）：將熒光抗體和未標記的抗體球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法處理切片。結(jié)果應(yīng)為陰性。為證明此種染色抑制不是由于熒光抗體被稀釋所致，可用鹽水代替未標記抗血清，染色結(jié)果應(yīng)為陽性。此法結(jié)果較二步法穩(wěn)定。③類屬抗原染色試驗，前面已作敘述。
直接法比較簡單，適合做細菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應(yīng)的抗原，特異性高而敏感性較低。
?。ǘ╅g接法
（1）切片固定后用毛細滴管吸取經(jīng)適當稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。
（2）再滴加間接熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等），同上步驟，染色30min，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。
對照染色：①抗體對照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進行染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。②抗原對照：即類屬抗原染色，亦應(yīng)為陰性。③陽性對照。
間接法中上述方法稱雙層法（Double Layer Method）。另一種稱夾心法，即用未標記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應(yīng)抗體結(jié)合，再用該抗原之熒光抗體重疊結(jié)合其上，而間接地顯示出組織和細胞中抗體的存在，方法步驟如下：
?、偾衅蛲科潭ê螅糜谌旧珴窈袃?nèi)。
?、诘渭游礃擞浀奶禺愋钥乖饔们衅?7℃，30min。
?、劬彌_鹽水洗2次，每次5min，吹干。
?、艿渭犹禺愋詿晒饪贵w再用切片于37℃，30min。
?、萑纰鬯础?/p>
?、蘧彌_甘油封固，鏡檢。
間接法只需制備一種熒光抗體可以檢出多種抗原，敏感性較高，操作方法較易掌握，而且能解決一些不易制備動物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查，所以已被廣泛應(yīng)用于自身抗體和感染病人血清的試驗。
（三）補體法
1．材料
?。?）免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers 鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4，1：8……。補體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補體熒光抗體等，按下述的補體法染色。免疫血清補體結(jié)合的效價，如為1：32則免疫血清應(yīng)作1：8稀釋。
?。?）補體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補體結(jié)合反應(yīng)試管法所測定的結(jié)果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中，溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。
?。?）抗補體熒光抗體：在免疫血清效價為1：4，補體為2單位的條件下，用補體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價，然后按染色效價1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。
2．方法步驟
?。?）涂片或切片固定。
?。?）吸取經(jīng)適當稀釋之免疫血清及補體之等量混合液（此時免疫血清及補體又都稀釋一倍）滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。
?。?）用緩沖鹽水洗2次，攪拌，每次5min，吸干標本周圍水液。
?。?）滴加經(jīng)過適當稀釋之抗補體熒光抗體30min，37℃，水洗同（3）。
?。?）蒸餾水洗1min，緩沖甘油封固。
3．對照染色
?。?）抗原對照。
?。?）抗血清對照：用正常兔血清代替免疫血清。
?。?）滅活補體對照：將補體經(jīng)56℃30min處理后，按補體同樣比例稀釋，與免疫血清等量混合后，進行補體法染色。
本法之熒光抗體不受免疫血清的動物種屬的限制，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應(yīng)用，敏感性亦較間接法高，效價低的免疫血清亦可應(yīng)用，節(jié) 省免疫血清，尤其是對檢查形態(tài)小的如立克氏體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質(zhì)時甚為理想。
?。ㄋ模┠た乖瓱晒饪贵w染色法
本法應(yīng)用直接法或間接法的原理和步驟，可對活細胞在試管內(nèi)進行染色，常用于T和B細胞、細胞培養(yǎng)物、瘤細胞抗原和受體等的檢查和研究，陽性熒光主要在細胞膜上。FACS即采用此法原理。
?。ㄎ澹╇p重染色法
在同一標本上有兩個抗原需要同時顯示（如A抗原和B抗原），A抗原的抗體用FITC標記，B抗原的抗體用羅達明標記，可采用以下染色方法：
1．一步法雙染色 先將兩種標記抗體按適當比例混合（A+B），按直接法進行染色。
2．二步法雙染色 先用RB200標記的B抗體染色，不必洗去，再用FITC標記的A抗體染色，按間接法進行。
結(jié)果：A抗原陽性熒光呈現(xiàn)綠色，B抗原陽性呈現(xiàn)桔紅色熒光。
?。晒饪贵w再染色法
若切片或其他標本經(jīng)某種熒光抗體染色后，未獲得陽性結(jié)果，而又疑有另外的病原體存在時，可用相應(yīng)的熒光抗體再染色。
有時存檔蠟塊不能再用以切片，也可用存檔的HE染色標本，褪去蓋片和顏色，再作免疫熒光或其它免疫細胞化學(xué)的染色。
三、熒光抗原染色法
某些抗原可以用熒光素標記，制成熒光抗原，標記熒光素的方法與制備熒光抗體方法相同。用熒光抗原可以直接檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗體，特異性較好，敏感性較差。染色方法同熒光抗體染色的直接法。由于多數(shù)抗原難以提純或量少不昂貴，一般很少采用此法。
第四節(jié) 熒光顯微鏡檢查法
一、熒光顯微鏡
熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學(xué)的基本工具。它是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長的光激發(fā)標本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標本的熒光圖像（圖3-15）。
圖3-15 熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)和主要部件
（一）光源
現(xiàn)在多采用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充一定數(shù)量的汞，工作時由兩個電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當水銀*蒸發(fā)時，可達50～70個標準大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強的紫外和藍紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。
超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高。
新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時間后，則需要高壓啟動（約為15000V），啟動后，維持工作電壓一般為50～60V，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開動一次工作時間愈短，則壽命愈短，如開一次只工作20min，則壽命降低50%。因此，使用時盡量減少啟動次數(shù)。燈泡在使用過程中，其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動。點燃燈泡后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不*而損壞電極，一般需要等15min。由于超高壓汞燈壓力很高，紫外線強烈，因此燈泡必須置燈室中方可點燃，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時造成操作。
超高壓汞燈（100W或200W）光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流、啟動幾個部分。在燈室上有調(diào)節(jié) 燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng)，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透鏡。
國產(chǎn)超高壓汞燈GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的進口燈泡，平均壽命在200h以上，價格也比較低。
我國研制的一種簡易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置，體積小，重量輕，功率小，交、直流兩用（自帶直流電源），易于攜帶，使用方便，已推廣應(yīng)用。
?。ǘV色系統(tǒng)
濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號，各廠家名稱常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調(diào)命名，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃，數(shù)字代表型號特點。如德國產(chǎn)品（Schott）BG12，就是種藍色玻璃，B是藍色的*個字母，G是玻璃的*個字母；我國產(chǎn)品的名稱已統(tǒng)一用拼音字母表示，如相當于BG12的藍色濾板名為QB24，Q是青色（藍色）拼音的*個字母，B是玻璃拼音的*個字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名，如K530，就是表示壓制濾長530nm以下的光而透過530nm以上的光。還有的廠家的濾板*以數(shù)字命名，如美國Corning廠的NO：5-58，即相當于BG12。
用于熒光顯微鏡的主要濾板如表3-1。
表3-1 熒光顯微鏡常用濾板型號和透光特點
| 基本色調(diào) | 相應(yīng)名稱 | 2mm厚透光范圍（峰值）nm | |||
| 上海電器元件廠 | 德國（Schott） | 蘇聯(lián) | 日本 | ||
| 黑紫 | ZWB-1 | UG-1 | yΦC-2 | DV-1 | 300～400（365） |
| 黑紫 | ZWB-2 | UG-5 | yΦC-1 | 280～240（360） | |
| 靛藍 | ZB-2 | BG-1 | ΦC-1 | BG-1 | 300～500（380） |
| 靛藍 | ZB-3 | BG-3 | CC-4 | BG-3 | 260～520（400） |
| 靛藍 | QB-24 | BG-12 | CC-8 | BG-12 | 310～570（420） |
| 淡藍 | QB-10 | BG-38 | C3C-5 | 310～720（460） | |
| QB-12 | -8 | ||||
| -11 | |||||
| 橙黃 | CB-3 | OG-1（K530） | OC-11 | OG-1 | 530以上 |
| 橙黃 | JB-8 | OG-4（K510） | ЖC-18 | FY-5 | 510以上 |
| 綠橙 | JB-7 | GG-11（K490） | ЖC-17 | FY-3 | 480以上 |
| FY-4 | |||||
| 淡綠 | JB-4 | GG-3（K430） | жC-11 | US-10 | 420以上 |
引自：五九一節(jié) 五*編：熒光顯微術(shù)，見參考資料）
1．激發(fā)濾板 根據(jù)光源和熒光色素的特點，可選用以下三類激發(fā)濾板，提供一定波長范圍的激發(fā)光。
紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。
紫外藍光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內(nèi)的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
紫藍光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過。常用型號為QB24（BG12）。
zui大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達明色素）可用藍綠濾板（如B-7）激發(fā)。
近年開始采用金屬膜干涉濾板，由于針對性強，波長適當，因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITCKP490濾板和羅達明的S546綠色濾板，均遠比玻璃濾板效果好。
激發(fā)濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些?；疽笫且垣@得zui明亮的熒光和的背景為準。
2．壓制濾板 壓制濾板的作用是*阻擋激發(fā)光通過，提供相應(yīng)濾長范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對應(yīng)，常用以下3種壓制濾板：
紫外光壓制濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。
紫藍光壓制濾板：能通過510nm以上濾長的熒光（綠到紅），能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。
紫外紫光壓制濾板：能通過460nm以上波長的熒光（藍到紅），可與BG-3組合，常用OG-11K470AK 490，K510。
?。ㄈ┓垂忡R
反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因為鋁對紫外光和可見光的藍紫區(qū)吸收少，反射達90%以上，而銀的反射只有70%；一般使用平面反光鏡。
（四）聚光鏡
專為熒光顯微鏡設(shè)計制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種。還有相差熒光聚光器。
1．明視野聚光器 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強，使用方便，特別適于低、中倍放大的標本觀察。
2．暗視野聚光器 暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛。因為激發(fā)光不直接進入物鏡，因而除散射光外，激發(fā)光也不進入目鏡，可以使用薄的激發(fā)濾板，增強激發(fā)光的強度，壓制濾板也可以很薄，因紫外光激發(fā)時，可用無色濾板（不透過紫外）而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強了熒光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質(zhì)量，觀察舒適，可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細微熒光顆粒。
3．相差熒光聚光器 相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時進行相差和熒光聯(lián)合觀察，既能看到熒光圖像，又能看到相差圖像，有助于熒光的定位準確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。
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各種物鏡均可應(yīng)用，但用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能（波長范圍）適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數(shù)成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大 時其影響非常明顯。因此對熒光不夠強的標本，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡，配合以盡可能低的目鏡（4×,5×，6.3×等）。
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在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過去多用單筒目鏡，因為其亮度比雙筒目鏡高一倍以上，但目前研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀察很方便。
?。ㄆ撸┞渖涔庋b置
新型的落射光裝置是從光源來的光射到干涉分光濾鏡后，波長短的部分（紫外和紫藍）由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射，當濾鏡對向光源呈45。傾斜時，則垂直射向物鏡，經(jīng)物鏡射向標本，使標本受到激發(fā)，這時物鏡直接起聚光器的作用。同時，濾長長的部分（綠、黃、紅等），對濾鏡是可透的，因此，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發(fā)濾板作用，由于標本的熒光處在可見光長波區(qū)，可透過濾鏡而到達目鏡觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而提高，在高放大時比透射光源強。它除具有透射式光源的功能外，更適用于不透明及半透明標本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養(yǎng)標本等的直接觀察。近年研制的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置，稱之為落射熒光顯微鏡。
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二、熒光顯微鏡標本制作要求
?。ㄒ唬┹d玻片
載玻片厚度應(yīng)在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時需用石英玻璃載玻片。
?。ǘ┥w玻片
蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(zhì)（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標本。
?。ㄈ吮?/p>
組織切片或其他標本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。
（四）封裱劑
封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。
?。ㄎ澹╃R油
一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標本時，必須使用鏡油，使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質(zhì)量略有影響。
三、使用熒光顯微鏡的注意事項
?。?）嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。
?。?）應(yīng)在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強光穩(wěn)定后，眼睛*適應(yīng)暗室，再開始觀察標本。
?。?）防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡。
（4）檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，zui多不得超過2～3h。
?。?）熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應(yīng)集中檢查，以節(jié) 省時間，保護光源。天熱時，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。
?。?）標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)。
（7）熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“一”—無或可見微弱熒光。“+”—僅能見明確可見的熒光。“++”—可見有明亮的熒光。“+++”—可見耀眼的熒光。
四、熒光圖像的記錄方法
熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時，必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展，在不同程度上采用客觀指標記錄判斷結(jié)果，如用細胞分光光度計，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果，也必須結(jié)合主觀的判斷。
熒光顯微鏡攝影技術(shù)對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微攝影系統(tǒng)裝置。
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第五節(jié) 非特異性染色的消除方法
一、非特異性染色的主要因素
組織的非特異性染色的機理很復(fù)雜，其產(chǎn)生的原因主要可分為以下幾點：
（1）一部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。
（2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。
（3）除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應(yīng)抗體結(jié)合。
?。?）從組織中難于提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。
?。?）抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。
?。?）熒光素不純，標本固定不當?shù)取?/p>
二、消除非特異性染色的方法
消除熒光抗體非特異性染色的方法應(yīng)根據(jù)產(chǎn)生的原因采取適當?shù)姆椒?，常用的方法有以下幾種：
?。ㄒ唬﹦游锱K器粉末吸收法
常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50～100mg,在離心管中充分混勻，在室溫中振動2h，4℃中過夜，再攪拌10min，高速離心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般應(yīng)在臨用前進行，吸收后之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色應(yīng)作吸收前后之比較，吸收時可先用緩沖鹽水將組織干粉浸濕，離心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入熒光抗體進行吸收，以免消耗過多的抗體。
肝粉或新鮮細胞吸收是一種非特異性的消除方法，對熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組織中的病毒抗原時，也可用相同的組織干粉或勻漿沉淀物吸收之。
用臟器肝粉吸收對熒光抗體損失較多，如果根據(jù)Hiramotos氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗2～3次，12000r/min 10min離心沉淀，用其沉淀物吸收其熒光抗體即能*達到目的，京極方久氏認為這樣吸收對熒光抗體幾乎沒有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用時有必要再吸收一次。
【肝粉的制法】
?。?）將若干只小白鼠或大白鼠放血殺死，取出肝臟，用生理鹽水洗2～3次，除去血液，剝掉表面的結(jié)締組織的脂肪。
?。?）剪碎，用生理鹽水反復(fù)洗滌至無血色止，然后再加生理鹽水少許，用組織搗碎機或勻漿器作成勻漿。
?。?）將肝勻漿裝入離心管內(nèi)（1/3左右），交換地用2～3倍量生理鹽水和丙酮反復(fù)洗滌各三次，至上清無血色止，每次完畢先用2000r/min離心沉淀15min后，再除去上清液。
?。?）zui后用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏斗過濾，或離心沉淀，將沉淀物平鋪在潔凈的玻璃板上，37℃烤干（過夜）。
?。?）在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過后，分裝，密封，低溫干燥保存。
?。ǘ┩肝龇?/p>
熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過，可將未與蛋白結(jié)合的熒光素透析除去。
?。?）將標記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內(nèi)，液面稍留空隙，緊扎。
（2）浸入0.02mol/ph 7.1～7.4的PBS中（懸于大于標記物體積約50～100倍的PBS內(nèi)），在4℃中透析，每日更換3～4次PBS，約5～7天，透析液中無熒即可（在熒光光源照射下）。
?。ㄈ┢暇厶悄zG-50柱層析法
除游離熒光素可用2×46cm柱層析法，詳細方法參閱第二章 。加入熒光抗體15～18ml（按床體積的5%～10%加樣），使其緩慢滲入柱內(nèi)，待即將全部入柱時，加入PBS少許，關(guān)閉下口，停留30～40min ，使游離熒光充分進入細篩孔中，然后再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留于上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來越大，熒光抗體zui先流出，分前、中、后三部分收集，測F/P比值，合格者合并，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測定蛋白（發(fā)生沉淀反應(yīng)），繼續(xù)洗脫，游離熒光素則相繼被洗脫下來，至洗脫液中無蛋白和熒光素后，此層析柱即可再用。
若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過柱前透析一夜，否則，NH4+太濃，在蛋白未*洗脫時即出現(xiàn)NH4+，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫液出現(xiàn)蛋白時，即進行收集，之后出現(xiàn)SO4++（用1%BaCl2檢查發(fā)生白色沉淀）。zui后是NH4+，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉淀），待洗脫液無SO4++及NH4+后可再用。
如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm的柱層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過濾2～3.5ml熒光抗體。
?。ㄋ模〥EAE纖維素柱層析法
標記過多或過少熒光素的抗體分子可用DEAE-纖維素柱層析法除去。方法如下：
DEAE-纖維素柱的裝柱，洗脫、再生方法等與提純IgG方法相同。裝柱所需DEAE-纖維素量以干重每克交換20～50mg標記蛋白量為宜。常用梯度洗脫法如下：
（1）層析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，標記物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脫，洗出無色或淡綠色液體，洗脫液量（根據(jù)床體積大小每梯度乘3），然后依下列各種離子強度洗脫液，分別洗脫和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/l NaCl）……洗脫部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/l NaCl）……洗脫部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/l NaCl）……洗脫部分3。
將此三部分收集液（每管5ml）分別測定其F/P比值，0.05mol/l NaCl pH7.2PB洗脫液280nm光密度高峰管合并，濃縮保存?zhèn)溆?。因這部分非特異性染色熒光zui少，是比較好的熒光抗體。其他兩部分可以廢棄。
（2）柱上吸附的過度標記蛋白可繼續(xù)增加NaCl的濃度至2.0mol/L洗脫完。
經(jīng)過DEAE-纖維素層析后的標記抗體，其抗體量一般約損失50%，因此有些要求不太高的抗體，如抗細菌熒光抗體，不一定要這樣處理，可用染色效價測定的稀釋法除去非特異性染色。
（五）熒光抗體稀釋法
先測定熒光抗體特異性染色與非特異性染色的效價，若二者效價相差較大，則可將熒光抗體稀釋至一臨界濃度，使特異性染色呈陽性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法和染色效價測定方法相同。
（六）純化抗原法
用各種方法提純單一成分的抗原是產(chǎn)生單價特異性抗體的zui主要條件。近代免疫化學(xué)技術(shù)（免疫吸收法）和柱層析法等提供了很大的可能性，可參考有關(guān)專著。
?。ㄆ撸┘兓贵w法---免疫吸收法
例如抗IgA血清的純化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（SIgA）抗原純度不高，所制的抗血清常與IgG呈交叉反應(yīng)，為此需要吸收，常采用純化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收純化。方法如下：
1．人IgG聚合物的制備 在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/l pH7.0磷酸緩沖溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，邊加邊攪，5min即出現(xiàn)混濁，逐現(xiàn)大塊膠塊，放置30min后，用研缽將凝膠磨細，繼用1.0mol/l pH7.0磷酸緩沖溶液反復(fù)洗滌3次，末次加蒸餾水至20ml，即為人IgG聚合物懸液。
2．免疫吸收法 將待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物懸液，置室溫攪拌60min,離心沉淀，上清液即稀釋1倍的純化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
?。ò耍┮廖氖纤{（Evans blue）襯染法
用0.01%伊文氏藍的0.01mol/l pH7.2PBS稀釋熒光抗體，可將背景細胞和組織染色，呈紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明的對比，減少了非特異性熒光，宜作常規(guī)應(yīng)用。伊文氏藍一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀釋至0.01%用以和然釋熒光抗體。
此外，還可以用胰酶消化組織切片或用10%牛血清蛋白封閉法等消除非特異性染色，提高特異性染