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   關(guān)注上海恒遠(yuǎn)生物，掌握科研資訊及科研實(shí)驗(yàn)中的那些事兒。不知您的免疫組化實(shí)驗(yàn)遇到瓶頸了嗎?今天小編給大家?guī)?lái)的是免疫組化的實(shí)驗(yàn)步驟剖析，希望您會(huì)喜歡！

1.標(biāo)本固定：固定的目的是①防止標(biāo)本從玻片上脫落；②除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；③固定的標(biāo)本易于保存。固定劑的選擇一般用 4%多聚甲醛。
2.脫水、石蠟包埋和制片：脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對(duì)組織要*浸蠟、切片時(shí)刀片要干凈和鋒利。否則，容易裂片和脫片等。
3.脫蠟和水化：這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。脫蠟可以先 60 度 20min，但當(dāng)天制好的切片一般先 60 度 3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脫蠟和水化不全易產(chǎn)生非特異性背景著色。
4.抗原修復(fù)：由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過(guò)程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過(guò)抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測(cè)率。常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH 的等）。
5.細(xì)胞通透：目的是使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用 Triton X-100、蛋白酶 k 等通透液。如 Triton X-100 可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。
6.滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素：在傳統(tǒng)的 ABC 法和 SP 法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易受到內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素的干擾，必須用過(guò)氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活
7.血清封閉：組織切片上有剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽(yáng)性；封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合；一般室溫 10- 30min。但也要防止封閉過(guò)度
8.一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間：一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中zui重要，包括孵育時(shí)間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種： 4 度、室溫、37 度，其中 4 度效果*；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般 37 度 1-2h，4 度過(guò)夜（從冰箱拿出后 37 度復(fù)溫 45min） 。具體條件還要摸索。二抗孵育條件：二抗一般室溫或 37 度 30min-1h，具體時(shí)間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。
9.抗體稀釋液：其實(shí)許多實(shí)驗(yàn)室抗體稀釋液就用一般 PBS 即可，但的抗體稀釋液中除 PBS 成份外，還加了*防腐劑、BSA 穩(wěn)定劑等組份，對(duì)抗體的多次回收利用較好
10.切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要，注意：①單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。②溫柔沖洗，防止切片的脫落，一般用浸洗方式；③沖洗的時(shí)間要足夠，才能*洗去結(jié)合的物質(zhì)。④PBS 的 PH 和離子強(qiáng)度的使用和要求（建議 PH 7.4- 7.6，濃度是 0.01M；  中性及弱堿性條件有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）
11.DAB顯色：背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由 DAB 孵育條件決定。 DAB 顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時(shí)即可沖洗
12.復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用蘇木素復(fù)染（胞核染料）
13.封片： 為了長(zhǎng)期保存，我們一般用中性樹(shù)膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對(duì)面的那個(gè)拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí)，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。