大鼠細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)酶聯(lián)免疫分析
試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
本試劑僅供研究使用              目的：本試劑盒用于測(cè)定大鼠血清，血漿及相
關(guān)液體樣本中細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)的含量。
實(shí)驗(yàn)原理：
    本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠細(xì)胞間粘附分子 1(ICAM-1) 水平。用純化的
大鼠抗細(xì)胞間粘附分子 1 抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入細(xì)
胞間粘附分子 1，再與 HRP 標(biāo)記的ICAM-1 抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)
過(guò)*洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)
化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的細(xì)胞間粘附分子 1 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm
波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中大鼠細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1) 含
量。
試劑盒組成：
試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存
說(shuō)明書(shū) 1 份 1 份
封板膜 2 片(48) 2 片(96)
密封袋 1 個(gè) 1 個(gè)
酶標(biāo)包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品：54ng/L 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1.5ml×1 瓶 1.5ml×1 瓶 2-8℃保存
酶標(biāo)試劑 3 ml ×1 瓶 6 ml ×1 瓶 2-8℃保存
樣品稀釋液 3 ml ×1 瓶 6 ml ×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑A 液 3 ml ×1 瓶 6 ml ×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑B 液 3 ml ×1 瓶 6 ml ×1 瓶 2-8℃保存
終止液 3ml ×1 瓶 6ml ×1 瓶 2-8℃保存
20倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶 30ml×1 瓶 2-8℃保存
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20分鐘左右(2000-3000 轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上
清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心
20分鐘左右(2000-3000 轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次
離心。
3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心 20分鐘左右(2000-3000 轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程
中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
2
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心 20分鐘左右(2000-3000 轉(zhuǎn)/
分)。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS (PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞
濃度達(dá)到100 萬(wàn)/ml 左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心 20分
鐘左右(2000-3000 轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的PBS ，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?br />用。標(biāo)本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS (PH7.4)，用手工或勻漿器
將標(biāo)本勻漿充分。離心 20分鐘左右(2000-3000 轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待
檢測(cè)，其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上
進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的(HRP )活性。
操作步驟：
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔 10孔，在*、第二孔中分別加標(biāo)
準(zhǔn)品100μl，然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl，混勻；然后從*孔、第二
孔中各取100μl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，
混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 棄掉，再各取 50μl 分別加到第五、第六孔
中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul ，混勻；混勻后從第五、第六孔中各
取50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl，混
勻后從第七、第八孔中分別取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)
品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取 50μl 棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl，
濃度分別為 36ng/L ，24ng/L ，12ng/L ，6ng/L，3ng/L)。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測(cè)樣
品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品 10μl(樣
品zui終稀釋度為 5 倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混
勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育30 分鐘。
4. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水 20倍稀釋后備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置 30秒后棄去，如此
重復(fù)5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同 3。
8. 洗滌：操作同 5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50 μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15分鐘.
10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。 測(cè)定應(yīng)在加終止
液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。
注意事項(xiàng)：
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未
用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間
3
控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高(樣本OD值
大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD值)，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n 倍)后再測(cè)定，計(jì)
算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請(qǐng)避光保存。
7．嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
10.  如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。
計(jì)算：
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，      
在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品的 OD          
值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋        
倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD值計(jì)算出標(biāo)        
準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式，將樣品的 OD值        
代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋        
倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。                                
試劑盒性能：
1. 樣品線(xiàn)性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R 值為0.990以上。
2. 批內(nèi)與批見(jiàn)應(yīng)分別小于 9%和11%                                   
保存條件及有效期：
1. 試劑盒保存：；2-8℃。